微流控芯片在單細胞捕獲中的應用

微流控單細胞分析的意義

細胞是生命體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，是認識一切生命現(xiàn)象的基礎和前提。傳統(tǒng)的基于細胞的生物學分析中，研究對象通常是數(shù)以十萬至百萬計的群細胞。隨著現(xiàn)代生物學的發(fā)展，這種傳統(tǒng)的細胞研究方式得到的“平均值”已經(jīng)不能滿足人們的需要，因為研究發(fā)現(xiàn)細胞間存在多樣性，或者說是異質(zhì)性。從細菌到真核細胞，這種異質(zhì)性越發(fā)顯著。以腫瘤異質(zhì)性為例，研究人員發(fā)現(xiàn)，同一種惡性腫瘤在不同患者個體間或者同一患體體內(nèi)的不同部位腫瘤細胞間均存在一定的差異，體現(xiàn)出惡性腫瘤的高度復雜性和多樣性。由此可見，需要建立有效分析單個細胞的化學信息，亦或是測定單細胞對外界刺激的反應的研究平臺。這不但能使人們更充分地了解細胞群體中某些特殊的細胞功能，更能鑒別大量細胞群體中少量的不正常細胞，為重大疾病的早期診斷和治療、藥物篩選和細胞間相互作用等研究提供可靠的科學依據(jù)。

盡管單細胞研究已被認為是21世紀生命科學研究的重要突破口，但是將單個細胞作為分析對象時，檢測平臺的構(gòu)建目前面臨以下4方面的巨大挑戰(zhàn)：（1）由于單細胞體積?。ㄎ⒚准墸麅?nèi)分析物的尺寸更?。▉單⒚准壣踔良{米級）且濃度極低，這就要求檢測平臺不但具有較強的分離與操控單個細胞的能力，而且應當具有較高的檢測靈敏度；（2）為了能夠有效地分析單細胞間的異質(zhì)性以及得到具有統(tǒng)計學意義的數(shù)據(jù)，往往需要檢測平臺能夠同時分析大量單細胞，即具有高通量和快速檢測的能力；（3）在一些動態(tài)觀察和分析單細胞的熒光、形態(tài)等研究需求中，檢測平臺應當具有實時顯微觀察的功能；（4）因需要分析與檢測的細胞數(shù)量通常很大，檢測及分析技術的開發(fā)應以簡單易行、經(jīng)濟實惠為前提，以提高其在應用時的普適性。

單細胞分析這一研究領域具有學科交叉性強的特點，因此，在眾多諸如生物學、物理學、材料學及計算機學等領域的科研工作者的共同努力下發(fā)展了很多單細 胞分析技術，包括流式細胞儀、熒光顯微成像技術和毛細管電泳技術等。這些技術的出現(xiàn)已經(jīng)使單細胞研究進入到了分子結(jié)構(gòu)的水平，但是這些方法均存在著一 些不足。例如，雖然流式細胞術是目前用于高通量表征單個細胞活動的最先進的技術，但它并不具有操控某個特定目標細胞或者是動態(tài)跟蹤觀察單個細胞的能力。而其他單細胞分析的方法，包括顯微成像、毛細管電泳等，雖然可以精準分析單細胞的組分和結(jié)構(gòu)，但是檢測通量較低。因此，為了滿足單細胞分析領域更高的研究需求，人們將目光轉(zhuǎn)向了微流控芯片這一新型操控及分析平臺。

微流控芯片（microfluidic chip），又稱芯片實驗室（lab-on-a-chip, LOC），是一種以微機電技術為基礎，以多維網(wǎng)絡微流道為結(jié)構(gòu)特征，目標是將化學或生 物樣品的采集、稀釋、反應、制備、檢測等基本操作步驟轉(zhuǎn)移和集成到很小的芯片上，最終實現(xiàn)常規(guī)化學或者生物實驗室的微型化和集成化。微流控芯片不僅具有體積輕巧、樣品及試劑使用量少、操作速度快、通量高、應用成本低等優(yōu)點，更重要的是，這種集成化的微芯片式自動分析平臺能夠有效避免人為操作產(chǎn)生的誤差，得到的數(shù)據(jù)可靠性更高。短短十幾年內(nèi)，微流控芯片已經(jīng)成為最前沿的研究領域之一，特別是在與單細胞相關的研究中，微流控芯片被認為是最具發(fā)展?jié)摿Φ母咄繂渭毎治銎脚_。微流控芯片中微米級的二維或三維通道為單個細胞的操縱提供了尺寸相匹配的結(jié)構(gòu)。根據(jù)不同的研究需求，微流控芯片系統(tǒng)可將多種單細胞研究所需的操作單元，如細胞操縱相關的微泵、微閥技術，單細胞捕獲技術以及檢測分析單元等設計并集成到微小的芯片平臺上。除此以外，微流控芯片的加工材料通常為聚二甲基硅氧烷（PDMS）及玻璃等，這類材料透明度高，生物相容性好，有助于單細胞的實時觀察與分析。綜上所述，相比傳統(tǒng)的單細胞分析方法，微流控芯片技術展現(xiàn)出巨大的應用優(yōu)勢，為單細胞相關的研究提供了更多的可能性。

微流控單細胞捕獲技術

在所有的微流控單細胞分析平臺開發(fā)中，都要面臨單細胞捕獲的問題，這主要指如何在微米級通道內(nèi)分離出單個細胞并將其固定在特定位置，以便于進行后期操作與分析檢測。微流控芯片上的單細胞捕獲過程應當兼具操作簡單高效和保證細胞活性的要求。目前已報道出多種微流控單細胞捕獲技術，其中，基于流體動力和液滴微流控的捕獲方法主要是通過合理地設計芯片中的微結(jié)構(gòu)，使得當細胞懸液以一定流速流過芯片時，即可實現(xiàn)高通量的單細胞捕獲，捕獲過程不需要施加其他外力；而基于光、電、聲、磁的捕獲法則是需要借助外力的作用驅(qū)使細胞移動到特定的捕獲位置，以實現(xiàn)高效、準確的高通量單細胞捕獲。下面逐一介紹這些技術的原理和應用，為單細胞分析相關領域的技術開發(fā)提供參考。

流體力學捕獲法

流體力學捕獲法是通過微加工的方式在微流控芯片中制備剛性障礙微結(jié)構(gòu)，從而可以將單個細胞從流動的細胞懸液中分離捕獲的方式。該方法主要包括兩種捕獲思路：一種是微篩式結(jié)構(gòu)，利用各種形狀的微擋板陣列攔截細胞，由于每個微擋板結(jié)構(gòu)只能攔截并容納單個細胞，因此當細胞懸液流過后即可形成單細胞捕獲陣列；另一種是微坑式結(jié)構(gòu)，主要是設計與單細胞尺寸相當?shù)陌疾劢Y(jié)構(gòu)陣列，當細胞懸液流過芯片時，細胞因自身的重力落入凹槽陣列中，形成單細胞陣列，并且細胞在落入凹槽后，受到的流體沖擊力很小，捕獲的細胞不易被沖走。 Carlo等研究了一種U型高密度單細胞捕獲陣列（圖1（a）），當細胞懸液流進芯片的捕獲區(qū)域時，其中一部分細胞會被卡在如圖1所示的這種“微壩”陣列處，最終形成高通量的單細胞捕獲陣列。Cooper等設計了一種如圖1（b）所示的包含有440個單細胞捕獲位點的微流控芯片，用于腫瘤單細胞的藥物動力學研究，結(jié)果表明利用這種可視化的芯片平臺對細胞凋亡的有效評估可以與流式細胞儀相比擬。Voldman等設計了一種雙向凹陷的微結(jié)構(gòu)陣列，實現(xiàn)兩種單細胞的捕獲、配對和融合，如圖1（c）所示。當一種細胞流過芯片時，會在雙向凹陷微結(jié)構(gòu)的一面被捕獲，此時將溶液反向流過后，捕獲的細胞會被沖到另一面的凹陷中，然后再次進樣捕獲另一種細胞，即可形成單細胞配對陣列，配對率達70%。Deutsch等在玻璃基底上通過刻蝕方式制備了高密度的蜂窩狀微坑陣列（圖1（d）），將細胞懸 液滴在陣列表面后蓋上蓋玻片，靜置幾分鐘后，細胞即可沉降落入微坑陣列中，形成單細胞陣列，而微坑的大小亦可根據(jù)細胞的種類不同而作相應的調(diào)節(jié)。這種高通量的單細胞捕獲陣列的構(gòu)建使得多種進一步的單細胞處理與分析，如熒光標記、酶動力學研究、胞內(nèi)組分分析等，均可實時在線完成。

（a）~（c）微篩式細胞捕獲陣列結(jié)構(gòu)示意圖及顯微圖片；（d）高密度蜂窩狀微坑細胞捕獲陣列

圖1 基于流體力學的微流控芯片上的單細胞操控

流體力學捕獲法操作過程簡單，無需使用特殊的緩沖液，通過合理地設計芯片中微通道及與細胞尺寸相當?shù)牟东@微結(jié)構(gòu)，即可實現(xiàn)高通量的單細胞捕獲，并且固定的捕獲位點適合于單細胞的實時觀察和追蹤分析。但是這種方法的芯片通常加工難度較大，成本較高，并且在進一步的單細胞分析中，可能會存在交叉污染的問題。

液滴微流控捕獲法

利用液滴微流控法捕獲單細胞是在封閉的微通道網(wǎng)絡中生成納升至皮升級液滴并將單個細胞包裹在液滴中的技術。這一技術不僅可以短時間內(nèi)生成大量單細胞液滴，而且每個液滴皆可作為獨立的單細胞微反應器，有效避免了交叉污染，最終可滿足多種單細胞的研究需求。目前，最常用于生成微液滴的方法T型通道法和十字型流體聚焦法，兩者都可以通過控制兩相流速來生成大小均一、性質(zhì)穩(wěn)定的液滴（圖2）。其中，T型通道結(jié)構(gòu)如圖2（a）所示，油相作為連續(xù)相，水作為分散相，分別從通道接口的兩端匯入，在表面張力與剪切力的共同作用下，分散相進入連續(xù)相中形成分散的液滴。十字型流體聚焦芯片結(jié)構(gòu)如圖2（b）所示，中間流道的分散相受到兩邊連續(xù)相的“擠壓”，即可穩(wěn)定地形成連續(xù)分散的液滴，這種芯片結(jié)構(gòu)產(chǎn)生液滴的過程更易于操控，液滴尺寸更均勻，范圍也更廣。從生物相容性和保證細胞存活的角度來說，用于包裹細胞的液滴通常采用的是油包水的形式。

圖2 T型通道法（a）及十字型流體聚焦法；（b）生成液滴示意

Pan等報道了一種用于觀測單細胞的生長增殖情況的液滴微流控芯片技術（圖3（a））。芯片的操作分為兩步，第一步是生成大量包裹著單細胞的微液滴，第二步則是將單細胞液滴取出進行觀察和分析；在取出單細胞液滴放置于芯片內(nèi)后，細胞間的相對位置便不再會發(fā)生變化，可用于觀察單細胞隨著時間變化的增殖情況及細胞間的差異的研究。Novak等用瓊脂糖液滴微流控技術進行了高通量的單細胞基因分析。他們先用瓊脂糖液滴將細胞和包含有引物的微球一同包裹在微液滴內(nèi)（圖3（b）），在細胞被裂解后基因組DNA則被留在了液滴內(nèi)，隨后將液滴與聚合酶鏈式反應（PCR）所需的反應物進行孵育，可直接在液滴內(nèi)進行PCR，最后將微球提取出來進行高通量的流式分析和DNA測序。值得一提的是，目前已經(jīng)有不少公司開發(fā)了基于液滴微流控芯片技術的檢測分析儀器，比如，英國Dolomite公司開發(fā)的液滴微流控系統(tǒng)可以在微流控芯片上快速生成大量尺寸可控、單分散性好的微液滴，液滴內(nèi)部可以再包含更小的液滴，且外部和內(nèi)部的微液滴在大小和形狀上都具有很好的一致性，為單細胞測序以及單細胞間相互作用等分析領域的研究提供了一種穩(wěn)定、高效的多功能分析平臺。美國10XGenom-ics公司基于液滴微流控的原理設計開發(fā)了高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺，可同時獲得103~104個細胞的表達信息，從而實現(xiàn)對細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測，也為腫瘤細胞異質(zhì)性，免疫細胞群體檢測以及胚胎發(fā)育等眾多研究領域提供了技術平臺。基于液滴微流控的單細胞捕獲芯片加工成本低，消耗試劑和樣品量少，捕獲速度快，特別適合于需要將單細胞和其他試劑獨立包裹在微液滴中進行單細胞分析的研究中，但是這種方法常存在單個液滴中無細胞包裹或多個細胞包裹的情況，并且包裹單細胞后的微液滴位置難以固定，不太適合特定單細胞的實時觀察。

圖3 微流控液滴生成與單細胞包裹圖

單光束激光捕獲法

單光束激光捕獲技術，又稱為光鑷，是一種可以通過高度匯聚的激光束形成三維勢阱，并利用束腰附近存在強大的梯度力捕獲并移動單個細胞的技術（圖4 （a））。如圖4（b）所示，通過光束的調(diào)控，光鑷能夠精準地捕獲一群細胞中的單個或多個目標細胞，并將其移動到特定的位置便于分析檢測。再如，光鑷可作為細胞融合的有效工具，將激光捕獲的2個細胞緊密接觸再融合，能使對細胞的損傷降至最低，也不會產(chǎn)生不期望的融合物（圖4（c））。進一步地，光鑷不僅可以精準地操控微米級的單個細胞，可以利用光束的穿透性實現(xiàn)對細胞內(nèi)部各種尺寸更小的細胞器進行操縱。

圖4 基于光鑷技術的微流控芯片中的單細胞捕獲

光鑷捕獲技術在單細胞的操控方面擁有獨特的優(yōu)勢，光鑷具有微米級范圍定位的能力，能夠精確地捕獲和移動單個細胞，而且光鑷不需要接觸細胞，因此整個操作甚至可以在完全密封的容器里進行，不會損傷細胞，污染少。但是，光鑷需要的設備要求較高，價格昂貴，并且不太適合應用于高通量的單細胞捕獲和分析領域。

介電電泳捕獲法

介電電泳現(xiàn)象由Pohl在1951年首先發(fā)現(xiàn)，描述的是非均勻電場中介電粒子被極化而受力產(chǎn)生的定向移動。如圖5所示，在不同的電極結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的不同的非均勻電場中，介電粒子會受正介電電泳力（p-DEP）作用向高電場或者受負介電電泳力（n-DEP）作用向低電場運動，最終在不同的位置被捕獲固定，從而實現(xiàn)粒子 的有效操控。同樣地，作為介電粒子的細胞被置于非均勻電場中時，只需通過改變施加電壓的大小和頻率等條件，細胞即可根據(jù)其所受到的介電電泳力進行移 動。近年來，研究人員將基于介電電泳的細胞操縱技術與微流控芯片技術相結(jié)合，得到了一系列高效可靠的單細胞研究平臺。

圖5 不同電極結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的非均勻電場中受正介電力和負介電力的粒子捕獲示意

Hunt等開發(fā)了一種“介電電泳鑷”（圖6（a）），將微電極制備在玻璃毛細管的針尖兩側(cè)，通過調(diào)整電壓、頻率等參數(shù)，可以靈活實現(xiàn)單個細胞的捕獲、釋放、移動等多種操控，但是每次只能對一個細胞進行分析，通量較低。Voldman等利用微加工技術制備了8組三維柱狀電極陣列（圖6（b）），每組分別包含4個微柱狀電極，并可作為一個獨立的單細胞操控單元，通過調(diào)節(jié)施加電壓的參數(shù)，可以利用介電電泳力選擇性地捕獲單細胞，而在斷電后，捕獲的單細胞會被釋放。Cheng等建立了一種平面式的基于介電電泳技術的高通量單細胞配對微流控芯片平臺（圖6（c）），兩種細胞懸液先后流經(jīng)微流控芯片并受強介電電泳力的作用被捕獲進入微孔陣列中，最終在1cm×1.5cm的捕獲區(qū)域完成了超過2400對的單細胞配對，配對效率達70%以上，這種高通量單細胞配對芯片有望應用于細胞的精準融合，細胞-細胞間相互作用等研究領域中。

圖6 基于介電電泳技術的微流控芯片上的單細胞捕獲

基于介電電泳技術的單細胞捕獲法具有操作簡單靈活、捕獲效率高、對細胞損傷小以及可實時觀察等優(yōu)點。但是，這一捕獲法通常需要使用特殊的緩沖液，合理地設計電極結(jié)構(gòu)及分析細胞受到的介電電泳力，對保證細胞的活性和實現(xiàn)高效的單細胞捕獲至關重要。

聲捕獲法

通過聲波結(jié)合微流控芯片進行細胞操控的方法，是指在芯片上施加一定的聲場，使芯片通道內(nèi)的細胞受到聲波力的作用驅(qū)使細胞遷移至特定位置。用于細胞操控的聲波分為體聲波駐波和聲表面駐波兩類。體聲波駐波操控細胞的原理是當超聲駐波激發(fā)微流體通道產(chǎn)生共振時，通道內(nèi)的細胞由于大小、質(zhì)量、密度等物理性質(zhì)的不同，將受到不同的聲波力的作用，從而可以將不同種類的細胞分成幾股液流，實現(xiàn)理想的細胞分離富集的預處理過程。Laurell等利用這種技術成功完成了血液清洗過程（圖7（a））。另一種聲表面駐波裝置，又稱為聲鑷，通過在微流控通道周圍放置叉指換能器用于形成表面駐波。在聲表面駐波的作用下，細胞將受到機械擾動并沿著流體上清晰的流線移動。與體駐波相比，聲表面駐波裝置可以提供的頻率范圍較大，更加有利于單個細胞的靈活操控，即能快速地將單個細胞捕獲在精確位置，而且細胞的活性不受影響，這一技術在微流控單細胞操控領域受到越來越多的關注。Huang等開發(fā)了一種利用聲表面駐波裝置實現(xiàn)高通量單細胞操控的微流控芯片，如圖7（b）所示。他們構(gòu)建的聲學裝置包含了兩對產(chǎn)生聲波的叉指換能器。當兩股聲波在微通道內(nèi)相遇時，形成的駐波會產(chǎn)生一系列的壓力節(jié)點，細胞在壓力節(jié)點處可被捕獲，并且通過調(diào)節(jié)聲波波長和相位，可以移動壓力節(jié)點從而靈活控制單細胞的捕獲位置。

圖7 基于聲波技術的微流控芯片上的細胞操控

聲表面駐波技術能實現(xiàn)無接觸、快速簡便的高通量單細胞捕獲，且用于捕獲的聲波能量對細胞無傷害，芯片制作較為簡單。與介電電泳技術類似，該技術對產(chǎn)生聲表面駐波的裝置的設計、制作及控制要求較高。

磁捕獲法

磁捕獲技術的工作原理是目標細胞與磁性微球發(fā)生非特異性或特異性吸附后，利用外加磁場的作用可以實現(xiàn)目標細胞的捕獲和排列。以基于腫瘤表面標志物的磁捕獲技術為例，目前大多數(shù)癌細胞表面具有一種叫上皮細胞黏附因子（epithelial cell adhesion mole-cule, EpCAM）的蛋白質(zhì)，通過在磁珠表面包被Anti-Ep-CAM抗體，即可與目標癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合，形成磁珠-細胞的復合物，然后在外加磁場的作用下，復合物受磁力作用被分離捕獲。Chan等將單個細胞包裹在一種雙色磁性微球中（圖8（a）），通過外加磁場操控雙色球，可以實現(xiàn)對單個細胞的操控。Kang等報道了一種基于磁珠捕獲技術的循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）分離微流控芯片，如圖8（b）所示。芯片內(nèi)包含有主通道以及通道兩邊的側(cè)腔結(jié)構(gòu)，側(cè)腔內(nèi)集成有磁鐵。他們以摻有少量乳腺癌細胞的小鼠血液作為樣本驗證器件的性能，癌細胞的表面吸附有磁珠，即當這種血液樣本流入芯片后，帶有磁珠的癌細胞會在磁場的作用下被捕獲入側(cè)腔結(jié)構(gòu)中，最終實現(xiàn)了90%的捕獲效率，并且捕獲得到的癌細胞能夠存活7天。

（a）雙色磁珠包裹單細胞圖片；（b）微磁-微流控CTCs分離芯片

圖8 基于磁捕獲技術的微流控芯片上的細胞操控

總體來說，磁捕獲技術對芯片結(jié)構(gòu)設計的要求不高，細胞捕獲也不需要復雜的外部設備。但是，捕獲操作之前需要先對細胞進行磁性粒子修飾，而且在基于抗原-抗體識別的免疫磁珠捕獲技術中往往還存在著抗體容易失活、價格昂貴、反應條件苛刻等一系列的缺陷，從而限制了其實際應用。

結(jié)論

經(jīng)過多年的發(fā)展，微流控單細胞捕獲技術已經(jīng)廣泛應用于單細胞相關領域的研究中，為進一步的單細胞生物學的研究提供了有力的保障。雖然目前這些微流控芯片單細胞捕獲方法多樣且有效，但是每種方法本身都存在一些不足。例如接觸式方法如液滴微流控技術設備簡單，但是往往捕獲效率不高；借助外力的非接觸式的捕獲方法操作溫和、效率高，但通常需要集成外部復雜的設備。因此，合理有效地結(jié)合多種微流控單細胞捕獲手段，最終發(fā)展更為簡單高效的單細胞捕獲技術，不僅能夠增強其在普通實驗室中的實用性，更為單細胞分析提供了更可靠的研究平臺。