類器官芯片與傳感器的結(jié)合

類器官芯片(organoids-on-chips)是傳統(tǒng)器官芯片在生物技術(shù)方面的延伸。近年來隨著組織工程和精密加工技術(shù)領(lǐng)域的迅速發(fā)展，使得體外類器官培養(yǎng)和類器官芯片成為生物醫(yī)學(xué)中極具特色而富有活力的新興領(lǐng)域。它融合了物理、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)和微機電等多個學(xué)科，是典型的交叉前沿科學(xué)技術(shù)。器官芯片在概念上包含類器官芯片，它是一種在芯片上構(gòu)建的生理微系統(tǒng)，以微流控芯片技術(shù)為核心，通過與細胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)等多種方法相結(jié)合，可以在體外模擬構(gòu)建包含有多種活體細胞、功能組織界面、生物流體和機械力刺激等復(fù)雜因素的組織器官微環(huán)境，反映人體組織器官的主要結(jié)構(gòu)和功能特征。而類器官芯片則是將器官芯片中的二維(2D)細胞由三維(3D)細胞或類器官取代。由于在三維環(huán)境培養(yǎng)中有一定剪切力的特性，其細胞更接近人體生理學(xué)狀態(tài)并且還具有一些2D細胞所沒有的器官功能，因此類器官芯片將在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。目前該領(lǐng)域還處于初級階段，國內(nèi)外對此研究都剛剛開始，但它的發(fā)展對未來人類健康和生物產(chǎn)業(yè)有著重要的戰(zhàn)略意義。從2004年最早的器官芯片報道以來，經(jīng)歷十多年的研究，器官芯片領(lǐng)域已經(jīng)取得了巨大的成功，它以前所未有的方式模擬和見證人體的多種生物學(xué)行為，在開發(fā)新藥、毒性測試、干細胞研究和了解疾病機制等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。不過作為其中的重要組成部分，平面培養(yǎng)的細胞在模擬真正在體生理特性方面還是存在一些不足，因此用體外3D培養(yǎng)的類器官替代芯片中傳統(tǒng)2D培養(yǎng)的細胞已經(jīng)成為目前器官芯片的研究要點；另外單純的依靠細胞染色技術(shù)檢測藥效毒理方面的結(jié)果也不能滿足快速發(fā)展的器官芯片領(lǐng)域，因此與現(xiàn)有先進的檢測傳感器聯(lián)合打造一體化的高內(nèi)涵多參數(shù)儀器系統(tǒng)將是未來發(fā)展的趨勢。

類器官研究現(xiàn)狀

在過去幾十年里，體外3D細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得科學(xué)家們研究一種更接近人體生理學(xué)特性的新型組織成為可能。類器官是指在結(jié)構(gòu)和功能上都類似某種器官或組織的模擬物，其中包含由干細胞或祖細胞獨立擴增并且分化的器官特異性上皮組織。在基質(zhì)膠的包埋下，不同來源的干細胞可以增殖分化并自組裝成類器官的結(jié)構(gòu)，而且還具備一定的器官功能，因此得名為類器官。Lancaster等人認為類器官是源于多能干細胞或器官祖細胞且具有胚層特異性的類器官體，其包含目標(biāo)器官中至少一種細胞類型，能夠自組裝為器官樣結(jié)構(gòu)并具有其生理結(jié)構(gòu)和功能特征。

最早在2009年，Sato等人證明3D上皮樣的小腸類器官可以通過單個富含LGR5標(biāo)記的小腸干細胞培養(yǎng)而成。在基質(zhì)膠的包埋下，小腸干細胞需要在無血清的條件(模擬體內(nèi)干細胞龕)下再添加R-spondin，LGR5配體，表皮生長因子以及骨形態(tài)生成蛋白進行培養(yǎng)。這種培養(yǎng)條件下的干細胞可以生長分化形成小腸隱窩和絨毛這樣的器官特性組織并且高度極性的表皮樣結(jié)構(gòu)。進一步的研究結(jié)果顯示，將體外培養(yǎng)的結(jié)腸類器官移植到硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠模型中可以修復(fù)其受損的結(jié)腸上皮，這表明利用單一成人結(jié)腸干細胞體外擴增進行結(jié)腸干細胞治療是可行的。目前，研究者甚至在人類腸類器官上已經(jīng)實現(xiàn)了用CRISPR-Cas9技術(shù)對其進行基因編輯，達到模擬結(jié)腸癌的效果。這種類器官培養(yǎng)體系能夠?qū)χ委熌c道相關(guān)疾病的藥物進行篩選，還能應(yīng)用于一些細胞因子對腸道損傷修復(fù)作用的研究。

這種培養(yǎng)方法開創(chuàng)了一個類器官培養(yǎng)時代，接下來多種鼠源或是人源的表皮樣類器官開始涌現(xiàn)，其中包括結(jié)腸、肝、胰腺、前列腺、胃、輸卵管、味蕾、唾液腺、食道、肺、子宮內(nèi)膜和乳腺。類器官可以長期培養(yǎng)、凍存和基因改造，這也使得它成為研究者眼里一個優(yōu)秀的疾病模型來源。在醫(yī)學(xué)上，癌是指起源于上皮組織的惡性腫瘤，具有難以早期發(fā)現(xiàn)、病程快、致死率高等特點。因此，作為疾病模型癌癥類器官成為了一個熱點領(lǐng)域，表1列舉了現(xiàn)在已經(jīng)報道培養(yǎng)成功的癌癥類器官。目前，類器官不僅是研究組織及器官發(fā)生、發(fā)展的有效工具，還能用于藥物療效和藥物毒理學(xué)性質(zhì)的檢測，更重要的是可以利用患者來源的干細胞深入研究疾病的發(fā)生機制、進行細胞和基因治療。另外，除了添加各種特定的生長因子來誘導(dǎo)分化干細胞外，Kuo課題組發(fā)表了一種全新的類器官培養(yǎng)方法，即在氣液界面上培養(yǎng)基質(zhì)支持細胞來提供必要的生長因子。這種方法增強了細胞的增殖和多向分化，使得更大的球形類器官得以產(chǎn)生。

表1 已報道的可以成功培養(yǎng)的癌癥類器官種類

目前，類器官的研究也存在一些局限。比如，雖然類器官在體外實驗中表現(xiàn)出自我更新和分化的能力，但是傳代次數(shù)有限；再者，體外培養(yǎng)大量細胞或組織一直存在無法再現(xiàn)生物體內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)，從而造成營養(yǎng)代謝障礙的問題。但這些缺陷一定程度上可以結(jié)合微納加工和微流控等工程技術(shù)得以解決，因此類器官芯片有著巨大的研究前景。

器官芯片和類器官芯片

器官芯片的尺寸較小，培養(yǎng)腔一般在毫米甚至微米級別，這就避免了一次實驗過程中使用過多細胞的浪費現(xiàn)象；而且多個培養(yǎng)腔的集成檢測也提高了通量，適合更多種藥物濃度梯度實驗和不同的對照實驗，更讓單細胞或單個類器官的個體差異性研究成為可能。另外，微流控作為器官芯片的核心技術(shù)就相當(dāng)于生物體內(nèi)負責(zé)運輸?shù)难?，這就很好地解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方式中營養(yǎng)代謝障礙的問題。

器官芯片

最早的器官芯片是由Huh等人開發(fā)的肺芯片，它是一種載玻片大小的雙層夾膜結(jié)構(gòu)，一側(cè)用于氣流通過，另一側(cè)用于培養(yǎng)液通過，在中間多孔的PDMS膜兩側(cè)分別培養(yǎng)氣管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞，從而達到模擬人體肺泡的氣液界面的效果；另外在肺芯片的兩側(cè)以循環(huán)抽真空的形式拉扯PDMS膜，使得培養(yǎng)在上面的細胞受到類似肺牽張作用，模擬肺泡呼吸的效果，這顯示了器官芯片的初級功能化(圖1(a))。在肺器官芯片基礎(chǔ)上，研究者通過在微通道中加入白細胞介素2，建立了肺水腫病理學(xué)模型；也通過氣路改進，控制有節(jié)律性的氣體進出，研究吸煙對肺細胞的影響以及損傷反應(yīng)(圖1(b))。該系列研究證實了肺芯片不僅可以模擬肺部疾病的病理過程，也發(fā)現(xiàn)了周期性呼吸運動在肺部疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為呼吸系統(tǒng)疾病研究提供了一種新的思路。

圖1 肺器官芯片構(gòu)建(a)和體外吸煙模型(b)

在肺器官芯片之后，相繼出現(xiàn)了肝器官芯片、腎器官芯片和血腦屏障芯片等。肝器官芯片是將肝細胞和內(nèi)皮細胞精確地分層種植，并在流動的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)可以構(gòu)建出有特定結(jié)構(gòu)的類肝血竇模型。腎器官芯片通過多維分區(qū)的功能化芯片設(shè)計與構(gòu)筑構(gòu)建了含有原代腎小球組織(腎小球內(nèi)皮細胞和足細胞等)、基質(zhì)成分和血管樣機械流體的動態(tài)三維系統(tǒng)，能夠模擬生理上的腎小球微環(huán)境和功能特征。血腦屏障芯片利用多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)構(gòu)建包含有多種腦細胞、細胞外基質(zhì)和機械流體條件等核心要素的動態(tài)三維血腦屏障模型，此芯片接近生理環(huán)境的結(jié)構(gòu)功能特性，并實現(xiàn)了對臨床抗腫瘤藥物穿透屏障能力的篩選與評價。這些器官芯片都通過微流控技術(shù)解決了持續(xù)新鮮培養(yǎng)基以及后續(xù)藥物等的供給問題，而且也通過工程手段實現(xiàn)了部分人體器官的功能，但在細胞培養(yǎng)方面都是以2D培養(yǎng)的細胞為基礎(chǔ)，所以還是存在不夠接近在體生理狀態(tài)的局限性。

類器官芯片

近年來，基于3D細胞的類器官芯片研究也日漸出現(xiàn)。Au等人研制了一種基于微流控技術(shù)的肝類器官藥物篩選平臺，它可以控制單個細胞凝膠團的運動，從而達到對單個類器官的檢測效果，這樣既能節(jié)省類器官使用數(shù)量，又可以提高實驗通量(圖2)。肝類器官是通過HepG2細胞和NIH-3T3細胞在水凝膠的環(huán)境下共培養(yǎng)而成的。實驗證明，這種類器官不僅展現(xiàn)出纖維細胞依賴的收縮特性，而且白蛋白的分泌和細胞色素P4503A4的活性都比2D培養(yǎng)的細胞要好(圖2(b))。研究者還利用該芯片成功檢測了不同濃度的對乙酰氨基酚(APAP，常見于泰諾)對肝類器官凋亡和壞死的情況。另外，Skardal等人在有平行流道的PDMS模具內(nèi)，利用紫外線交聯(lián)的透明質(zhì)酸聚合物來原位構(gòu)造微小肝組織。經(jīng)過一周的培養(yǎng)就可以得到用于肝毒性檢測的穩(wěn)定3D組織。

圖2肝類器官芯片的研究。(a)3D肝類器官微流控藥篩裝置；(b)通過熒光強度比較2D與3D培養(yǎng)細胞對藥物作用的反應(yīng)

最近,秦建華團隊發(fā)表了一個以人誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSCs)分化的肝類器官所制的三維灌注芯片。這項國際領(lǐng)先的研究成果不同于其他以3D共培養(yǎng)細胞為對象的類器官芯片，首次真正做到了把類器官引入到芯片中，并做了不同濃度的APAP藥物毒性實驗，這對人們了解器官形成、疾病機理和藥物測試有著巨大的推進作用。近年來，癌癥類器官的研究也是一大熱點，因此越來越多的癌癥類器官芯片也開始涌現(xiàn)。它不僅可以評價各種新開發(fā)藥物對癌癥的治療效果，也可以研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機制。由細胞系或是病人來源的肺癌細胞形成的3D球體也是抗癌藥物敏感性篩選的良好載體，而且3D球體還可以與成纖維細胞共培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系的3D球體有更強的抗藥性。另外，也有學(xué)者將癌癥類器官芯片用于全新治療方法的研究，Yang等人制作了一種3D乳腺癌芯片來評價光能療法(PDT)效果。類器官芯片的用途非常廣泛，利用工程學(xué)原理和多學(xué)科集成手段構(gòu)建了3D類器官模型以及多器官集成芯片系統(tǒng)，可以對基礎(chǔ)生物學(xué)研究、毒性測試和干細胞等多個領(lǐng)域產(chǎn)生深遠的影響。

類器官芯片與傳感器的結(jié)合

目前的類器官芯片還基本處于以微流控為核心的研究階段，各種流道的設(shè)計都是有利于培養(yǎng)環(huán)境的改進，使得類器官更接近人體生理狀態(tài)。但是芯片中的類器官在藥物作用響應(yīng)方面的檢測一般都使用傳統(tǒng)的細胞染色技術(shù)，然后再通過熒光顯微鏡來判別細胞活性。這種方法不僅操作復(fù)雜，花費較高，而且很難做到對類器官的動態(tài)實時檢測，因此引入傳感器檢測將是一個很好的選擇。

首先類器官芯片與電阻抗傳感器的結(jié)合可以實現(xiàn)動態(tài)檢測類器官的整體生長情況。Eichler等人研究了平板2D細胞和立體3D球體細胞在阻抗傳感器表面的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)這兩者之間具有顯著差異性。這可能是因為2D和3D模型的邊緣細胞形態(tài)不一致，且兩種模型細胞之間、細胞與細胞基質(zhì)之間的相互作用也不一樣。但該研究是在96孔細胞培養(yǎng)板上完成的，因此還未達到類器官芯片中培養(yǎng)液循環(huán)更新的效果。傳統(tǒng)的電阻抗傳感器在檢測水凝膠包被下的類器官會受到水凝膠絕緣的影響，因此在細胞生長或是凋亡過程中難以檢測到細胞指數(shù)(CI)值的改變。筆者團隊正在克服此項難點，目前主要有兩個方向有望突破。一是將某種導(dǎo)電的物質(zhì)混入在水凝膠中與細胞一起培養(yǎng)。這對材料的要求較高，不僅需要物質(zhì)微粒直徑小(納米級別)，而且還需要很好的導(dǎo)電性，最重要的是其生物相容性，在培養(yǎng)過程中不能影響細胞活性；二是通過設(shè)計專門的3D阻抗傳感器，檢測凝膠和細胞總體的阻抗。由于凝膠的阻抗值在培養(yǎng)過程中基本穩(wěn)定不變，細胞在低頻率時被視為非導(dǎo)體，因此凝膠/細胞結(jié)構(gòu)的總阻抗值主要由細胞數(shù)目決定。通過分析總阻抗值的變化趨勢，可以進一步分析3D培養(yǎng)的細胞活性和數(shù)目。圖3所示的為我們自主研發(fā)的3D阻抗傳感器，它可以實時監(jiān)測3D細胞或類器官的對于不同藥物的反應(yīng)。

圖33D阻抗傳感器。(a)3D阻抗傳感器的構(gòu)造；(b)3D阻抗傳感器的等效電路；(c)八通道的3D阻抗傳感系統(tǒng)；(d)實時檢測3D細胞和基質(zhì)膠的細胞生長曲線結(jié)果

如果僅僅檢測細胞的增殖與凋亡這一參數(shù)，對于類器官芯片最重要的應(yīng)用藥物篩選來說顯然不夠全面。比如作用于心臟或是神經(jīng)細胞的藥物，我們需要了解其對細胞發(fā)放電信號的頻率和幅值的改變。這就需要仿生芯片與微電極陣列(MEA)傳感器的結(jié)合。Frega等人構(gòu)建了動態(tài)檢測3D海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的MEA傳感器芯片。體外3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是將細胞培養(yǎng)在功能型支架上構(gòu)成的，這種體系將對刺激和記錄神經(jīng)元活動和研究神經(jīng)生理學(xué)機能有很大幫助。筆者團隊也做了此方面研究(圖4)：將原代心肌細胞種植在通過3D打印制成的具有空間結(jié)構(gòu)的支架上，打印的墨水材料為聚乳酸和聚己內(nèi)脂。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，心肌細胞之間會相互連接形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時產(chǎn)生有節(jié)律的電信號發(fā)放。我們設(shè)計的MEA芯片可以檢測生長在3D支架上的心肌細胞胞外場電位信號(EFP)幅值和發(fā)放頻率，以及不同藥物對電位信號的影響，同時在不同材料和形狀的支架里選擇最優(yōu)的方案。

圖4 基于MEA傳感器的3D心肌細胞監(jiān)測

除了電位信號，類器官培養(yǎng)微環(huán)境中的各種離子和蛋白大分子標(biāo)志物的含量也是藥物篩選中重要的指標(biāo)。在基礎(chǔ)生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，光尋址電位傳感器(LAPS)通常用于監(jiān)測細胞的代謝，主要是能量代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物的檢測。細胞通過新陳代謝維持正常的生理活動，細胞攝入各類營養(yǎng)物質(zhì)，通過糖酵解或者呼吸作用，產(chǎn)生能量ATP，同時排出乳酸或者二氧化碳，這些酸性產(chǎn)物會發(fā)生水解產(chǎn)生氫離子，因而能量代謝最終會引起酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，并使胞外微環(huán)境中的pH降低。這種pH的波動可以通過相應(yīng)光生電流的信號變化被LAPS傳感器檢測到。另外LAPS還能檢測Na+、K+、Ca2+

等離子以及多肽蛋白等生物大分子，是一個真正能達到多參數(shù)檢測的傳感器。目前所知，國內(nèi)外關(guān)于類器官芯片與LAPS傳感器結(jié)合的研究很少，筆者團隊是其中之一。我們設(shè)計了將LAPS芯片集成在類器官培養(yǎng)腔內(nèi)的原位檢測芯片(圖5)以及將類器官培養(yǎng)微環(huán)境中的溶液通過微流控導(dǎo)入到LAPS芯片上的復(fù)合系統(tǒng)。在微流控系統(tǒng)的幫助下，PDMS培養(yǎng)腔內(nèi)的3D細胞或類器官可以長時間培養(yǎng)，相應(yīng)的物質(zhì)檢測也可以實時地進行。通過對LAPS芯片分析類器官培養(yǎng)微環(huán)境中各項代謝產(chǎn)物的變化，實現(xiàn)對類器官生理狀態(tài)的監(jiān)測。

圖53D多參數(shù)LAPS傳感器。(a)各種代謝產(chǎn)物通過芯片上不同的敏感膜進行原位檢測；(b)培養(yǎng)在PDMS腔體內(nèi)的3D細胞；(c)、(d)3D多參數(shù)LAPS芯片斜視圖和側(cè)視圖

人體仿生芯片展望

類器官仿生芯片能在體外近乎真實地模擬人體內(nèi)的生理和病理狀態(tài)，從而能預(yù)測藥物或是其他刺激所產(chǎn)生的應(yīng)對反應(yīng)。這在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究、臨床疾病模擬和新藥研發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。類器官仿生芯片一個最重要的應(yīng)用是藥物篩選，因此不同種類的癌癥類器官芯片將在藥物評價中發(fā)揮重大作用。由于藥物在人體內(nèi)需要經(jīng)歷吸收、分布、代謝、排泄的一整套過程，因此多種類器官芯片通過微流控技術(shù)連接起來可以研究藥物對不同器官的藥效以及相應(yīng)的副作用，這也就是人體芯片的全新概念(圖6)。人體芯片的研究為藥物研發(fā)、疾病認識、化學(xué)品和毒素檢測等領(lǐng)域提供了一種更接近生理狀態(tài)的體外模型，具有廣泛的應(yīng)用價值。由于人體器官仿生芯片高度模擬人體狀態(tài)這一特點，在未來將很有可能替代動物實驗，這大大減少了藥物研制的成本和進行臨床前人體實驗的時間，同時能更加了解新藥的毒性作用和人體對藥物的代謝反應(yīng)。

圖6 多器官人體仿生芯片示意圖

人體器官仿生芯片作為人類健康領(lǐng)域的高精尖技術(shù)，在疾病研究、個性化醫(yī)療、毒性預(yù)測和新藥研發(fā)等各領(lǐng)域都起著非常重要的作用，它的發(fā)展前景吸引了各方面的關(guān)注，不久的將來會孕育出杰出的科學(xué)突破。伴隨著該技術(shù)進一步的發(fā)展，未來利用人體器官芯片的組合連接有可能構(gòu)建一種完整的生命模擬系統(tǒng)，這將徹底改變我們了解自身的方式，為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個學(xué)科研究提供一種整體性和系統(tǒng)性的解決方案。