利用納米孔測序技術(shù)在DNA鳥嘌呤的烷基化堿基損傷檢測方法學(xué)研究中取得重要進(jìn)展

南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃碩課題組利用納米孔測序技術(shù)在DNA鳥嘌呤的烷基化堿基損傷檢測方法學(xué)研究中取得重要進(jìn)展，于2019年4月25日在《德國應(yīng)用化學(xué)》發(fā)表論文“Nanopore sequencing accurately identifies the mutagenic DNA lesion O6-carboxymethyl guanine and reveals its behavior in replication”。

細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)（活性氧、亞硝基化合物等）和一些環(huán)境因素（UV、電離輻射等）會(huì)攻擊人類的遺傳物質(zhì)DNA，造成DNA雙鏈斷裂、脫堿基以及各種修飾堿基等多種形式的化學(xué)損傷。如果沒有被正確修復(fù)，DNA損傷會(huì)對遺傳物質(zhì)的準(zhǔn)確傳遞產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡。鳥嘌呤的烷基化損傷O6-carboxymethylguanine（O6-CMG）是DNA損傷中的一種，其存在會(huì)引導(dǎo)DNA復(fù)制過程中的G-A堿基顛換，進(jìn)而導(dǎo)致DNA序列的永久性改變，如原癌基因K-ras和抑癌基因p53發(fā)生的G-A基因突變?；?qū)用鎸?shí)現(xiàn)O6-CMG的精準(zhǔn)定位將對靶向修復(fù)烷基化堿基損傷，建立早期腫瘤標(biāo)志物等領(lǐng)域提供寶貴信息，具有極大的科研價(jià)值。目前對O6-CMG的檢測方法包括免疫親和液相色譜法（immunoaffinity-HPLC fluorescence assay）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS/MS）等。但這些方法需要酸化水解O6-CMG，并且對DNA鏈進(jìn)行消解，從而破壞了原始序列。現(xiàn)有的二代測序平臺雖然能夠?qū)τ贒NA序列進(jìn)行測序，但卻無法對O6-CMG進(jìn)行直接測序檢測。因此現(xiàn)階段尚未有一種方法可以實(shí)現(xiàn)O6-CMG在基因中的精準(zhǔn)定位。

納米孔測序技術(shù)是新興的單分子測序方法。原理上說，納米孔測序技術(shù)可以在單分子水平直接讀取堿基序列，且無需基因擴(kuò)增，是檢測修飾堿基最直接的方法。O6-CMG分子結(jié)構(gòu)特殊，屬于罕見的帶有負(fù)電荷的修飾堿基，同時(shí)具有較大的分子尺寸，與所有天然堿基和大部分表觀遺傳學(xué)修飾有直接的理化性質(zhì)區(qū)分。以上所述的分子結(jié)構(gòu)在納米孔測序中預(yù)期會(huì)產(chǎn)生特異性極強(qiáng)的測序信號，然而對O6-CMG的納米孔測序檢測此前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

南京大學(xué)黃碩課題組和瑞士巴塞爾大學(xué)Dennis Gillingham課題組合作，利用納米孔測序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單分子水平上的O6-CMG的高特異性檢測。該合作團(tuán)隊(duì)通過設(shè)計(jì)特殊的DNA模式序列，并用化學(xué)合成的手段在模式序列的不同位置引入一個(gè)或多個(gè)O6-CMG修飾堿基，進(jìn)而在納米孔測序過程中直接觀測到了O6-CMG產(chǎn)生的特異性測序信號。O6-CMG在納米孔測序中表現(xiàn)為極高的測序電流信號，與天然堿基信號顯著區(qū)分，并借此實(shí)現(xiàn)O6-CMG在DNA序列中的精準(zhǔn)定位。在所展示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，O6-CMG的單次測序事件識別正確率可高達(dá)95%以上。三次重復(fù)測序即可達(dá)到99.9%以上的Consensus正確率。相較于傳統(tǒng)方法而言，該方法具有單分子檢測精度，保留了原始堿基上的官能團(tuán)修飾，同時(shí)還能獲取O6-CMG周圍的堿基序列，是目前實(shí)現(xiàn)O6-CMG直接精準(zhǔn)定位的唯一方法。

在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，該團(tuán)隊(duì)在單分子測序?qū)嶒?yàn)中意外發(fā)現(xiàn)O6-CMG會(huì)在單分子水平對phi29 DNA聚合酶產(chǎn)生復(fù)制阻礙，具體表現(xiàn)為奇異的動(dòng)力學(xué)特征，并有望借助該單分子酶動(dòng)力學(xué)特征實(shí)現(xiàn)對一系列類似修飾堿基的深度區(qū)分，原則上可以實(shí)現(xiàn)對O6-CMG等一系列堿基損傷的100%精準(zhǔn)分辨。

圖1. O6-CMG分子式及O6-CMG測序機(jī)理示意圖。左上：O6-CMG的化學(xué)結(jié)構(gòu)。藍(lán)色標(biāo)注為羧甲基修飾部分。右上：納米孔測序機(jī)理，納米孔最窄處為測序信號識別位點(diǎn)，O6-CMG在經(jīng)過識別位點(diǎn)時(shí)，匯報(bào)測序信息。下：納米孔測序原始電流數(shù)據(jù)：紅色部分電流信號為O6-CMG所產(chǎn)生的特異性信號。隨著phi29 DNA聚合酶進(jìn)一步延伸DNA 模板鏈，O6-CMG進(jìn)入聚合酶合成位點(diǎn)，從電流信號觀測到O6-CMG無法被phi29 DNA聚合酶延伸，且表現(xiàn)為前進(jìn)與后退交替進(jìn)行的單分子酶動(dòng)力學(xué)特征。

該工作由南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院黃碩課題組和瑞士巴塞爾大學(xué)化學(xué)學(xué)院Dennis Gillingham課題組共同完成，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院17級碩士研究生王宇與瑞士巴塞爾大學(xué)化學(xué)學(xué)院博士后Kiran M. Patil為共同一作，黃碩教授與Dennis Gillingham教授為論文共同通訊作者，南京大學(xué)為第一通訊單位。

論文主要完成單位黃碩課題組主要從事單分子生物納米孔器件原創(chuàng)研發(fā)與醫(yī)療檢測應(yīng)用。近年來，黃碩課題組在該研究領(lǐng)域有多項(xiàng)成果發(fā)表，包括開發(fā)了一種新型的納米孔錯(cuò)位測序方法（nanopore-induced phase-shift sequencing, NIPSS, Chemical Science, 2019, 10(10): 3110-3117.）和新型光學(xué)納米孔技術(shù)（Osmosis-Driven Motion-Type Modulation of Biological Nanopores for Parallel Optical Nucleic Acid Sensing. ACS applied materials & interfaces, 2018, 10(9): 7788-7797.），為納米孔測序拓展更多應(yīng)用出口。

此項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：91753108、21327902、21675083）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（國際科技合作促進(jìn)項(xiàng)目）（項(xiàng)目編號： 020514380142、020514380174）、生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（項(xiàng)目編號：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、江蘇省雙創(chuàng)計(jì)劃等經(jīng)費(fèi)支持。