法國(guó)oxxius激光器在光流控流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用

隨著人類(lèi)社會(huì)現(xiàn)代化高速發(fā)展，由于各種原因?qū)е碌陌┌Y已經(jīng)成為嚴(yán)重危害健康的頭號(hào)殺手，下圖為2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。因此對(duì)癌細(xì)胞的早期篩查和前期診斷是保障患者生命安全的重要手段，現(xiàn)在常用的組織活檢存在取樣困難，代表性差以及并發(fā)癥高的風(fēng)險(xiǎn)，而影像學(xué)和血清檢測(cè)又不夠靈敏。于是，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）液體活檢的光流控流式細(xì)胞術(shù)由于分子信息全面、采樣方便、侵入小、無(wú)放射性污染、成本低等優(yōu)點(diǎn)成為了最具潛力的檢測(cè)手段。下面小編就來(lái)帶你了解一下光流控流式細(xì)胞術(shù)。

首先，什么是CTCs?

循環(huán)腫瘤細(xì)胞這一概念于1869年阿什沃斯醫(yī)生提出，通俗的講這一概念指的是腫瘤細(xì)胞從腫瘤母體脫離并以體液（一般為外周血）為傳播手段進(jìn)行轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，其中部分腫瘤細(xì)胞可能會(huì)在此過(guò)程中凋亡，但也有部分腫瘤細(xì)胞存活成為惡性腫瘤，導(dǎo)致患者死亡，轉(zhuǎn)移過(guò)程如下圖。

然后，什么是CTCs檢測(cè)？

CTCs檢測(cè)技術(shù)大致包括密度梯度離心法、過(guò)濾法、免疫磁性分離、Cell Collectors、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)這幾種。我將簡(jiǎn)單介紹這幾種。密度梯度離心法利用腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞密度不同的特點(diǎn)采用離心分離將腫瘤細(xì)胞置于分離液上層，雖然操作簡(jiǎn)單但是對(duì)血液樣品質(zhì)量要求高且準(zhǔn)確性也不理想。過(guò)濾法采用直徑很小的濾膜將腫瘤細(xì)胞滯留分離，雖然不依賴于細(xì)胞特異性標(biāo)記但是也存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。免疫磁性分離是以含有特異性抗體的磁珠與含有表面特異性抗原的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，在磁場(chǎng)的作用下與磁珠結(jié)合的腫瘤細(xì)胞被暫時(shí)吸引，從而與其他細(xì)胞分離，而達(dá)到特異性分離，分離效果很好但極度依賴特異性抗原。Cell Collectors是利用功能結(jié)構(gòu)針插入病人靜脈30分鐘進(jìn)行CTCs分離，針上帶有抗體可以識(shí)別分離腫瘤細(xì)胞表面抗原，但是此方法具有侵入性。然后是流式細(xì)胞術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)經(jīng)熒光染色或標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和篩選，此方式常用的工具為流式細(xì)胞儀，但傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀由于對(duì)精度的要求導(dǎo)致測(cè)試的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)甚至更久，因此科學(xué)家們提出了一種改進(jìn)的方式，即為光流控流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)，此技術(shù)分為光流控和流式細(xì)胞術(shù)兩部分。
什么是光流控技術(shù)？
光流控作為一項(xiàng)將光學(xué)與微流控芯片相結(jié)合的新技術(shù)，可以將細(xì)胞操縱和光學(xué)檢測(cè)等過(guò)程集合在一塊芯片上完成，是一種細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2019年 巴沙爾·哈姆扎等人首先將光流控系統(tǒng)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)，以30ml/min的速度從小鼠體內(nèi)抽取血液并利用微流控芯片對(duì)血液中CTCs進(jìn)行檢測(cè)與篩選。能夠較為快速地檢測(cè)分離出CTCs，并可將得到的CTCs進(jìn)行后續(xù)分析。效果如下圖。

盡管這一技術(shù)較之傳統(tǒng)CTCs檢測(cè)有著巨大優(yōu)勢(shì)，但是由于微流控芯片自身功能限制的原因使得此技術(shù)只能獲取部分CTCs從而導(dǎo)致無(wú)法分析腫瘤細(xì)胞集群間差異，而且此技術(shù)過(guò)程復(fù)雜，對(duì)于光學(xué)部分也有著較高要求。

對(duì)于前者我們只能要求微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作能夠精益求精，技術(shù)過(guò)程復(fù)雜可通過(guò)合理的規(guī)劃施予減輕，這里我們主要談?wù)劰饬骺亓魇郊?xì)胞術(shù)的光學(xué)檢測(cè)模塊。山東師范大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)們搭建了一種高效的光學(xué)模塊，光學(xué)檢測(cè)模塊是對(duì)CTCs進(jìn)行靈敏性高、取樣參數(shù)多、實(shí)時(shí)高通量單細(xì)胞表征與分型計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞熒光信息的識(shí)別及特征分析、檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)與分析。在該檢測(cè)模塊中，488nm和638nm雙波長(zhǎng)激光器（L6C-488/638-150-023，法國(guó)Oxxius公司）發(fā)出的合束激光（如果覺(jué)得雙激光器光路搭建繁瑣，也可使用法國(guó)oxxius公司多波長(zhǎng)合束激光器）通過(guò)擴(kuò)束準(zhǔn)直組件、全反射鏡M1、多截止波長(zhǎng)二向色鏡MDM和反射鏡M2后形成平行光束進(jìn)入鏡物OB（20x，NA為0.42），由物鏡OB聚焦到焦平面上，在距離十字交叉口下方3mm處的檢測(cè)通道中心形成一個(gè)直徑約20μm的近圓形檢測(cè)區(qū)域，以激發(fā)流經(jīng)檢測(cè)區(qū)域的細(xì)胞產(chǎn)生熒光和散射光。檢測(cè)區(qū)域的熒光被同一物鏡收集后形成平行光束透過(guò)全反射鏡M2反射和多邊緣分色分光器（透射率>93%）透過(guò)后，到達(dá)分光鏡 DM1（透射率>95%），因此物鏡收集到的熒光約90% x 93%≈86%進(jìn)入熒光檢測(cè)通道。被多邊緣分色分光器透射的熒中，綠色熒光被二色分光鏡DM1反射至熒光檢測(cè)通道1（APD1），透過(guò)二色分光鏡DM1的黃色熒光被DM2反射至熒光檢測(cè)通道2（APD2），透過(guò)DM2紅色熒光則被二色分光鏡DM3反射至熒光檢測(cè)通道3（APD3），而透過(guò)DM3的近紅外熒光則被投射到熒光檢測(cè)通道4（APD4）。綠色熒光檢測(cè)通道入口處放置了濾光片F(xiàn)1，只有波長(zhǎng)范圍510–530nm之間的光可以通過(guò)；黃色熒光檢測(cè)通道入口處放置了濾光片F(xiàn)1，只有波長(zhǎng)范圍在560–590nm之間的光可以通過(guò)；紅色熒光檢測(cè)通道入口出放置了濾光片F(xiàn)3，只有波長(zhǎng)范圍在650-690nm的光可以通過(guò)；近紅外熒光檢測(cè)通道入口出放置了濾光片F(xiàn)4，只有波長(zhǎng)范圍在700-740nm的光可以通過(guò)。濾光片可以過(guò)濾掉絕大部分雜散光；而位于針孔（P1-4）前150mm處的透鏡AL1-3將原來(lái)的平行光線匯聚到針孔處,消除了非共焦位置產(chǎn)生的熒光等。緊貼著針孔（P1-4）處放置了單光子計(jì)數(shù)的雪崩光電二極管模塊APD，這樣可以非常靈敏地將接收到的熒光轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)。如下圖。

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審核編輯：符乾江