十偏振分辨倍頻顯微鏡及其圖像處理介紹的詳細(xì)說(shuō)明

　　在非線(xiàn)性光學(xué)顯微鏡中，二倍頻（SHG）成像通常用于觀(guān)測(cè)內(nèi)源性纖維狀結(jié)構(gòu)，且 SHG 的強(qiáng)度很大程度上取決于入射光束的偏振方向與目標(biāo)分子取向軸之間的相對(duì)角度。因此，基于偏振的 SHG 成像（P－SHG），可通過(guò)分析 SHG 信號(hào)強(qiáng)度與入射光束的偏振態(tài)之間的函數(shù)關(guān)系，來(lái)獲得目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)信息。其現(xiàn)在已用作醫(yī)學(xué)和生物學(xué)分析的重要工具。簡(jiǎn)單的 SHG 圖像可以通過(guò)傳統(tǒng)的雙光子激發(fā)熒光顯微鏡（TPM）獲得。大多數(shù) TPM 系統(tǒng)仍采用基于運(yùn)動(dòng)鏡面的單束掃描方法，其時(shí)間分辨率取決于鏡面的物理移動(dòng)速度。為了實(shí)現(xiàn)更高速的成像，TPM 系統(tǒng)還可以采用多束掃描的方法（圖 1A），其中之一便是利用轉(zhuǎn)盤(pán)掃描單元。該單元由共軸的微透鏡轉(zhuǎn)盤(pán)和針孔轉(zhuǎn)盤(pán)構(gòu)成，兩個(gè)轉(zhuǎn)盤(pán)上的微透鏡和針孔一一對(duì)應(yīng)。激光在通過(guò)微透鏡轉(zhuǎn)盤(pán)時(shí)，波前會(huì)覆蓋多個(gè)微透鏡，不同微透鏡將波前各部分聚焦到不同的位置，并穿過(guò)對(duì)應(yīng)的針孔，形成多個(gè)微光束。這些微光束打到樣品上，可同時(shí)激發(fā)多個(gè)信號(hào)。這些信號(hào)沿顯微鏡系統(tǒng)返回并再次穿過(guò)針孔，最后被兩個(gè)轉(zhuǎn)盤(pán)之間的二向色鏡反射到檢測(cè)裝置中。然而，常規(guī)使用的鎖模鈦寶石激光器作為光源能量不足，限制了激發(fā)光束的數(shù)量，導(dǎo)致使用轉(zhuǎn)盤(pán)掃描單元的 TPM （TPM－SD） 的有效視場(chǎng) （FOV） 很小。 Ai Goto 等人想通過(guò) TPM－SD 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高速的 P－SHG 成像，并保證大的 FOV，故在 TPM－SD 系統(tǒng)中引入了峰值功率更高的基于 Yb 的激光光源。圖 1 是他們開(kāi)發(fā)的 TPM－SD 系統(tǒng)示意圖。該系統(tǒng)光源為基于 Yb 的激光器，產(chǎn)生的飛秒脈沖中心波長(zhǎng)為 1042 nm、平均功率 4 W、脈寬 300 fs，重復(fù)頻率 10 MHz。系統(tǒng)首先通過(guò)半波片和格蘭激光偏振器來(lái)調(diào)節(jié)激光功率，接著通過(guò)擴(kuò)束器進(jìn)行擴(kuò)束，擴(kuò)束后的光束被引入到轉(zhuǎn)盤(pán)掃描單元中，接著從掃描單元出來(lái)的多個(gè)微光束通過(guò)水浸物鏡被聚焦在樣品的多個(gè)點(diǎn)上。為了調(diào)整光束在物鏡處的偏振態(tài)，激發(fā)光束的光路上放置了一個(gè)半波片和一個(gè)四分之一波片。為了測(cè)量樣品上入射光束的偏振態(tài)，在物鏡后端放置了一個(gè)線(xiàn)性偏振膜。在這項(xiàng)研究中，他們使用了圓偏振光（圖 1B；橢圓度 0．95）和 4 種線(xiàn)偏振光束（圖 1C－F；橢圓度 0．2－0．3）。以 FOV 的水平軸為基準(zhǔn)，將橫向偏振角設(shè)置為 0、45、 90 和 135°。物鏡收集到的熒光或 SHG 光通過(guò)針孔轉(zhuǎn)盤(pán)，被二向色鏡反射至偏振分束器。偏振分束器將信號(hào)分離為一對(duì)偏振分辨信號(hào)，它們被放大倍數(shù)為×1．2 的中繼透鏡分別聚焦在電子倍增 CCD 相機(jī)的不同方形檢測(cè)區(qū)域上，從而同時(shí)獲取一對(duì)矩形圖像。軸向掃描是通過(guò)壓電驅(qū)動(dòng)器實(shí)現(xiàn)的。