如何去制作一種便攜式毛細(xì)管實(shí)時熱對流PCR儀

引言

由于尺寸大，成本高和擴(kuò)增時間長，傳統(tǒng)的 PCR 熱循環(huán)儀僅限于主要醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室。

最近，通過簡化設(shè)備結(jié)構(gòu)并減少擴(kuò)增時間，開發(fā)了新平臺。一種解決方案是利用溫度梯度誘導(dǎo)產(chǎn)生自然對流，從而提升 DNA 的擴(kuò)增。

當(dāng)試劑由于自然對流效應(yīng)而在溫度區(qū)域之間反復(fù)循環(huán)時，試劑將在一次循環(huán)中經(jīng)歷 PCR 循環(huán)的三個步驟 (即核酸變性，退火和延伸)。因此，對流 PCR 可以將擴(kuò)增時間從數(shù)小時縮短到 30-40 分鐘。

通過使用這種機(jī)制，不需要專用的熱循環(huán)儀。實(shí)時對流 PCR 設(shè)備也可以結(jié)合熒光檢測器來設(shè)計(jì)。

然而，當(dāng)前的對流 PCR 系統(tǒng)采用兩個或更多個獨(dú)立的溫度控制器，且需要設(shè)計(jì)特定形狀的管子或腔，以使樣品液徹底流通。此外，某些操作需要特定的技巧，如從細(xì)管中裝載和卸載試劑以及密封管的兩端而不將氣泡困在里面。每一步操作對 PCR 成功擴(kuò)增都至關(guān)重要。

儀器設(shè)計(jì)

圖 1 所示為儀器示意圖，該儀器由光源，測量熒光強(qiáng)度的光學(xué)系統(tǒng)，用于維持 95℃ 恒定溫度的可控?zé)嵯到y(tǒng)組成。采用藍(lán)色 LED 提供 450-520nm 的寬帶光作為 DNA 量化實(shí)驗(yàn)的光源。

采用 CCD 相機(jī)通過 530 nm 光學(xué)濾光片來測量 PCR 混合物反射的熒光強(qiáng)度的寬光譜響應(yīng)。

該機(jī)器包含一個半導(dǎo)體制冷器 (thermoelectric cooler) 和一個風(fēng)扇，分別用于升高和降低外殼溫度。將半導(dǎo)體制冷器放置在 銅支架基板和海綿之間以形成加熱器件。將熱電偶插入半導(dǎo)體制冷器中來確定銅支架基板的溫度，以保持 95℃ 的恒定溫度。

圖 1 儀器圖解視圖

樣品容器采用底部封閉的商用玻璃毛細(xì)管( 100ul )。毛細(xì)管長 32mm，內(nèi)徑和外徑分別為 2.3mm 和 3.2mm。

毛細(xì)管在 95°C 的固定溫度下從底部加熱，在試管內(nèi)形成溫度梯度并產(chǎn)生自然對流，從而引起試劑在毛細(xì)管中自發(fā)循環(huán)，從而完成 DNA 的擴(kuò)增過程(變性，退火和延伸)。

該項(xiàng)研究采用了乙型肝炎病毒 (HBV) 作為模板?DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。將 122 bp 的HBV DNA 模板與毛細(xì)管中制備的引物相混合。

表 1 列舉了所用到的試劑。本文采取高-內(nèi)徑比為 7.7，體積為 75 μL 的毛細(xì)管來進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。

計(jì)算分析

當(dāng)在毛細(xì)管下方加熱流體時，底層中的流體顆粒比頂層中的流體顆粒更溫暖和更輕。因此，流體的流動有上升的趨勢，而粘性力 (viscous forces) 的作用會減慢顆粒的向上運(yùn)動。這個過程被稱為瑞利-貝納德 (Rayleigh-Bénard) 不穩(wěn)定性，導(dǎo)致對流運(yùn)動的產(chǎn)生。

鑒于該過程涉及到的浮力和粘性力，不穩(wěn)定性受 瑞利數(shù)(Ra) 控制，其定義如下：

其中，

?? :?重力加速度

??：流體熱膨脹系數(shù)?

??,???: 腔室內(nèi)?流體頂部(冷)和底部的溫度(熱)

??: 流體的高度

??:?熱擴(kuò)散率

??:?運(yùn)動粘度 (kinematic viscosity)

當(dāng)瑞利數(shù)超過臨界值時，便會發(fā)生對流現(xiàn)象 (不穩(wěn)定的浮力引起流體在腔室上下表面循環(huán)運(yùn)動)。Ra 是影響對流腔室內(nèi)流體流動性能 (stream function)，速度和溫度分布的關(guān)鍵參數(shù)。影響熱流體流動的另一個參數(shù)是 ??。其中，??是腔內(nèi)徑。

因?yàn)?，PCR 擴(kuò)增效率受試劑和溫差影響，因此，只能通過更改腔體高度來更改Ra，而將幾何形狀作為流量控制的主要參數(shù)。

對于 PCR 熱循環(huán)，因反應(yīng)在水溶液 (aqueous solution) 中進(jìn)行，因此其流體性質(zhì)是恒定的(??、??)。

結(jié)果和討論

圖 3 所示，(a) 由瑞利-貝納德對流控制的模擬溫度場。為觀察內(nèi)部流動結(jié)構(gòu)，在去離子水中注入直徑為 50um 的聚苯乙烯顆粒 (密度 ??)可視化的顆粒路徑如 3b 所示。?(c) 預(yù)測時間和速度輪廓。視頻見下 1 。

圖 3

在毛細(xì)管中，流體的滾動運(yùn)動使得樣品經(jīng)歷退火和延伸，DNA 模板從管頂部掉落并再次加熱實(shí)現(xiàn) PCR 循環(huán)。模擬和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，單個 PCR 周期大約需要 30 s 。因?yàn)橥瓿梢粋€ PCR 流程需要 55-60 個循環(huán)，所以預(yù)計(jì)完成整個 DNA 擴(kuò)增的總反應(yīng)時間約為 28min 。

本文采用目標(biāo) DNA 片段 (HBV 122 bp) 進(jìn)行 DNA 定量測量，目標(biāo) DNA 的初始拷貝數(shù)范圍為??拷貝/ uL 至 ??拷貝/ uL。

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