新型高效抗反射金屬材料實現(xiàn)激光解吸附離子化質(zhì)譜分析

質(zhì)譜成像是一種結(jié)合質(zhì)譜分析的分子成像技術(shù)，可以同時獲得分子的空間分布信息和化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，在生物標記物的靶向分析以及疾病標記物的發(fā)現(xiàn)中有著重要的意義。日前，清華大學(xué)精密儀器系歐陽證、馬瀟瀟教授課題組與材料學(xué)院鐘毓霖教授課題組合作，利用以銅為基底的微納米復(fù)合錐體陣列抗反射材料（對紫外輻射平均吸收率高達97％），實現(xiàn)了無需基質(zhì)的激光解吸附離子化質(zhì)譜分析。

研究背景

基質(zhì)輔助激光解吸附離子化（matrix-assisted laser desorption/ionization， MALDI）質(zhì)譜技術(shù)使用紫外激光掃描樣品表面獲得質(zhì)譜信息，是目前應(yīng)用最廣泛的質(zhì)譜成像技術(shù)，尤其適合生物大分子和高聚物的分析。該技術(shù)是采用短的脈沖激光（1-10ns）使樣品分子離子化后進入質(zhì)譜儀分析。

但傳統(tǒng)MALDI質(zhì)譜成像需要在組織切片表面均勻噴涂小分子基質(zhì)，不僅流程繁瑣耗時，還可能改變分析物在組織中的分布。此外，基質(zhì)使用及噴涂不均勻會造成低質(zhì)量端背景干擾、成像重現(xiàn)性差、空間分辨率低等一系列問題。

近些年來，研究人員開發(fā)了一系列固體基底材料替代小分子基質(zhì)實現(xiàn)激光解吸附離子化（laser desorption/ionization， LDI），主要包括納米材料、納米結(jié)構(gòu)和納米粒子等。目前，大部分LDI基底材料仍存在制備過程復(fù)雜、使用壽命短、易被污染、離子化效率低等問題，發(fā)展一種高效耐用的基底材料是提高LDI質(zhì)譜檢測實用性和有效性的關(guān)鍵。

研究進展

為解決上述問題，清華大學(xué)精密儀器系歐陽證教授和馬瀟瀟教授團隊近年來致力于發(fā)展無基質(zhì)激光解吸附離子化（LDI）質(zhì)譜成像技術(shù)。通過與清華大學(xué)材料學(xué)院鐘敏霖教授合作，利用一種新型高效抗反射（anti-reflection， AR）金屬材料做載樣基底，可在不使用基質(zhì)化合物的情況下實現(xiàn)樣品分子的激光解吸附和離子化（圖1），提高分析速度，避免背景干擾。

該材料通過一步超快激光刻蝕在銅表面原位加工制成（圖1（b）），具有周期性微米級錐孔陣列結(jié)構(gòu)和表面覆蓋的大量納米顆粒結(jié)構(gòu)（圖1（c）），可有效束縛和吸收入射光，對紫外輻射的平均吸收率高達97％。因此，AR材料可以有效捕獲LDI紫外激光（355 nm）并將其轉(zhuǎn)換成熱能，促進分析物發(fā)生“局部爆炸”，實現(xiàn)解吸附和后續(xù)的離子化過程。該抗反射材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，清洗后可重復(fù)使用200——400次。

圖1 （a） 使用抗反射材料做LDI基底檢測酵母細胞樣本的原理示意圖，箭頭表示光捕獲原理

圖1（b）抗反射材料（黑色區(qū)域為抗反射材料）; （c）抗反射材料掃描電鏡圖; （d） 酵母細胞的AR-LDI質(zhì)譜圖，酵母細胞直接滴加至材料表面，可檢測到多種代謝物離子峰

2018年，該團隊在Research上發(fā)表了基于抗反射材料的激光解吸附離子化質(zhì)譜檢測方法（Research， 2018， DOI： 10.1155/2018/5439729）。采用銅微納復(fù)合錐體陣列抗反射材料（對紫外輻射平均吸收率高達97％）為基底，實現(xiàn)了無需基質(zhì)的激光解吸附離子化，以及對糖類、氨基酸、藥物分子等生物小分子的高靈敏度檢測和對洋蔥提取液和酵母細胞中代謝物的快速直接質(zhì)譜檢測。

然而，銅材料的高導(dǎo)熱性會造成局部熱量的擴散，并降低質(zhì)譜檢測靈敏度。為減少熱量擴散，該團隊采用熱導(dǎo)率更低的不銹鋼，并在表面修飾聚多巴胺（polydopamine，PDA）制備不銹鋼抗反射復(fù)合材料，進一步提高了質(zhì)譜分析的靈敏度和生物分析的兼容性。PDA具有合成方便、穩(wěn)定、可修飾到多種表面、良好的生物相容性等優(yōu)點。同時，PDA在300 nm附近的強光吸收可有效增強激光解吸離子化效率。質(zhì)譜分析和成像結(jié)果表明，聚多巴胺-不銹鋼抗反射復(fù)合材料具有良好的解吸附離子化特性，可用于生物組織中甘油三酯（TAG）、甘油二酯（DAG）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、鞘磷脂（SM）、膽固醇酯（CE）以及溶血磷脂酰膽堿（Lyso PC）的高效質(zhì)譜檢測。對鼠腦組織切片的高分辨率（50 μm）質(zhì)譜成像同時獲得了20余種磷脂分子的空間分布和結(jié)構(gòu)信息，表明磷脂分子在小鼠大腦灰質(zhì)區(qū)、白質(zhì)區(qū)和胼胝體呈現(xiàn)截然不同的區(qū)域和豐度分布（圖2）。

圖2. （a）不銹鋼抗反射材料（AR-SS）和聚多巴胺修飾的不銹鋼抗反射材料（PDA-AR-SS）的掃描電鏡圖。（b）使用PDA-AR-SS做基底實現(xiàn)LDI質(zhì)譜成像的原理示意圖；（c）使用PDA-AR-SS對鼠腦組織切片的質(zhì)譜成像結(jié)果。

清華團隊利用該方法研究了肥胖小鼠（ob/ob）肝臟組織中的脂類含量和分布（圖2）。實驗結(jié)果表明，相比正常小鼠，肥胖小鼠肝組織中的甘油三酯含量顯著增加，并呈離散狀分布；而正常小鼠肝臟組織中PC、PE等分子的含量更高。以上結(jié)果表明聚多巴胺-不銹鋼微納復(fù)合抗反射材料可實現(xiàn)高空間分辨率質(zhì)譜成像，無需在生物組織上噴覆基質(zhì)，從而大大簡化了分析流程，避免了基質(zhì)背景干擾，且基底材料清洗后可反復(fù)使用200次以上，對推動質(zhì)譜成像在疾病診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

圖3. 使用PDA-AR-SS做基底，對肥胖小鼠和正常小鼠肝臟組織的LDI質(zhì)譜成像。

上述研究成果近期發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces 上（ACS Appl. Mater. Interfaces 2019， 11， 49， 46140-46148， DOI： 10.1021/acsami.9b16260）。

未來展望

該抗反射金屬材料可用于多種生物分子的高靈敏度檢測，為激光解吸附和離子化質(zhì)譜提供了一種通用、高效、快速的軟離子化技術(shù)，可用于大量生物樣品的高通量分析。之后，該團隊又通過對該材料表面的多巴胺修飾，改善了材料的生物相容性及質(zhì)譜檢測靈敏度，且避免了常規(guī)質(zhì)譜成像的繁瑣、耗時的基質(zhì)噴涂流程，大大簡化質(zhì)譜成像流程。

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