蘇州醫(yī)工所等在病原菌感染快速診斷研究中取得進(jìn)展

世衛(wèi)組織專家估計(jì)，到2050年，抗生素耐藥導(dǎo)致的死亡人數(shù)可能會(huì)大幅增加。導(dǎo)致耐藥菌出現(xiàn)和蔓延的一個(gè)主要原因是在治療感染類疾病時(shí)存在濫用和過(guò)度使用抗生素的情況。目前，病原菌感染在臨床的檢驗(yàn)流程如圖1所示，需要3至7天才能從病人標(biāo)本中分析出病原菌鑒定和抗生素藥敏的結(jié)果?？焖?a target="_blank">檢測(cè)感染細(xì)菌的藥敏特性對(duì)確保有效抗生素的使用和減少對(duì)廣譜藥物的需求發(fā)揮關(guān)鍵作用。那么，應(yīng)如何準(zhǔn)確且快速的判斷感染細(xì)菌的藥敏特性呢？

近期，中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所宋一之、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院王明貴和英國(guó)牛津大學(xué)Wei Huang聯(lián)合團(tuán)隊(duì)合作，利用單細(xì)胞拉曼光譜-重水標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)，開發(fā)出一種適用于血液和尿液標(biāo)本的快速藥敏檢測(cè)方法（FRAST），該方法將尿液和血液標(biāo)本的藥敏檢測(cè)時(shí)間由3至4天分別縮短為3小時(shí)和21小時(shí)。

圖1 傳統(tǒng)尿液和血液樣本的藥敏檢測(cè)時(shí)間與FRAST的比較

FRAST方法基于拉曼光譜——重水標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)，其主要原理為：細(xì)菌可通過(guò)重水（氘代水）培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)氘元素的標(biāo)記，使拉曼光譜中的碳-氘峰成為單細(xì)胞水平細(xì)菌代謝活動(dòng)的標(biāo)記物。在抗生素作用下，易感菌代謝活性會(huì)受到抑制，耐藥菌則不受影響并產(chǎn)生明顯的碳-氘峰，因此，可克服臨床微生物試驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的要求，使快速藥敏成為可能。

FRAST方法的具體流程如圖2所示。對(duì)于尿液感染標(biāo)本，研究人員首先進(jìn)行離心收集細(xì)菌，然后在共聚焦顯微拉曼系統(tǒng)下對(duì)細(xì)菌觀察并采集拉曼指紋圖譜，這一過(guò)程可判斷尿液中是否有菌及菌量，同時(shí)將采集到的圖譜利用機(jī)器學(xué)習(xí)模型與革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)樣品中細(xì)菌的革蘭氏陰陽(yáng)性并以此選擇合適的藥敏板。將尿液加入到藥敏板并作用1 h后加入重水，待重水標(biāo)記1 h后離心洗滌樣品并采集拉曼信號(hào)，通過(guò)對(duì)抗生素作用下的C-D峰的強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)計(jì)算讀取最小抑菌濃度（MIC）。對(duì)于血液標(biāo)本，則是在血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后用同樣的方法采集拉曼光譜并計(jì)算MIC值。

圖2 FRAST用于臨床尿液樣本和血液樣本的藥敏試驗(yàn)流程圖

該研究中，研究人員對(duì)包含質(zhì)控菌株和臨床原始標(biāo)本在內(nèi)的超過(guò)3000個(gè)樣本采集了6萬(wàn)余張單細(xì)胞拉曼光譜，并與臨床金標(biāo)準(zhǔn)（微量肉湯稀釋法或臨床自動(dòng)藥敏系統(tǒng)）進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，F(xiàn)RAST方法對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%（圖3），藥敏結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)總體一致率大于88%。與其他基于Raman-DIP的病原菌藥敏研究相比，該研究在國(guó)際上首次證明單細(xì)胞拉曼與重水標(biāo)記結(jié)合可用于分析真實(shí)的尿液或血液標(biāo)本中病原菌的耐藥性，而且基于拉曼的革蘭氏染色預(yù)測(cè)方法的整合使FRAST成為相對(duì)獨(dú)立完整的測(cè)試方法，臨床醫(yī)生無(wú)須其他手段輔助，即可完成“從樣本到報(bào)告”的快速診斷。與近年來(lái)發(fā)展較快的耐藥分子診斷技術(shù)相比，F(xiàn)RAST藥敏是基于抗生素對(duì)細(xì)菌作用的表型，因此，該結(jié)果不會(huì)因未知的耐藥機(jī)制或基因表達(dá)調(diào)控影響而產(chǎn)生對(duì)藥敏的誤判。

圖3 FRAST方法可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)病原菌的革蘭氏染色分類結(jié)果

相關(guān)研究成果以Development of a Fast Raman-Assisted Antibiotic Susceptibility Test (FRAST) for the Antibiotic Resistance Analysis of Clinical Urine and Blood Samples為題，發(fā)表在Analytical Chemistry上。研究工作得到科學(xué)技術(shù)部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院科研儀器設(shè)備研制等的資助。

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