基于納米孔的DNA計(jì)算技術(shù)檢測(cè)microRNA表達(dá)模式的方法

miRNA是一類(lèi)小分子量的非編碼RNA片段，通過(guò)與靶向mRNA結(jié)合，發(fā)揮基因沉默和翻譯抑制的功能。miRNA通過(guò)調(diào)控生物體一系列的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，可以幫助生物體應(yīng)對(duì)各種各樣的環(huán)境變化，維持正常的生命活動(dòng)。因此，理解miRNA的發(fā)生調(diào)控過(guò)程，尤其是miRNA在不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同生理狀態(tài)時(shí)的含量，顯得尤為重要。

納米孔檢測(cè)技術(shù)作為20世紀(jì)90年代中期發(fā)展至今的一種分析手段，因?yàn)槠錈o(wú)標(biāo)記、高靈敏等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)逐漸成為化學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一種重要的單分子級(jí)別的分析檢測(cè)方法。而基于納米孔的核酸分析是納米孔檢測(cè)領(lǐng)域中最成功的方向，尤其是基于納米孔測(cè)序方法開(kāi)發(fā)的第三代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中。因此，納米孔檢測(cè)技術(shù)有望在miRNA的分析檢測(cè)中做出獨(dú)特的貢獻(xiàn)。

近期，來(lái)自東京農(nóng)工大學(xué)的Ryuji Kawano教授在JACS Au上發(fā)表了題為“Pattern Recognition of microRNA Expression in Body Fluids Using Nanopore Decoding at Subfemtomolar Concentrations”的文章，提出了一種使用發(fā)夾DNA探針的miRNA檢測(cè)方法，理論上實(shí)現(xiàn)了膽管癌樣本中阿摩爾水平（10?1?M）的miRNA檢測(cè)。

研究人員使用的實(shí)驗(yàn)裝置如圖1a、b所示，選擇miR-193、miR-106a、miR-15a、miR-374和miR-224作為靶標(biāo)miRNA，因?yàn)檫@些miRNA已經(jīng)被報(bào)道在人的膽管癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。接下來(lái)，研究人員設(shè)計(jì)了一條可以與這五種miRNA互補(bǔ)配對(duì)的5’端含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA-HP-dgDNA（圖1c），HP-dgDNA和miRNA配對(duì)后的熱力學(xué)模擬結(jié)構(gòu)如圖1d所示。當(dāng)與miRNA雜交的HP-dgDNA通過(guò)αHL納米孔時(shí)，互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈區(qū)域在電壓驅(qū)動(dòng)下發(fā)生解旋，且解旋時(shí)間隨著互補(bǔ)配對(duì)位置個(gè)數(shù)減少而減少（圖1e），因此，可以通過(guò)雜交鏈的解旋過(guò)孔時(shí)間來(lái)大致判斷有幾種miRNA與HP-dgDNA發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)。

為了驗(yàn)證該檢測(cè)方法的可行性，研究人員首先使用合成miRNA分別制備了膽管癌miRNA樣品（存在5種miRNA）和兩種健康的miRNA樣品（存在1或3種miRNA）。三種樣品分別與HP-dgDNA雜交，含1種（圖2a）、3種（圖2b）或5種（圖2c）miRNA樣品的過(guò)孔時(shí)間如圖所示。其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2d所示，可以看到含有3種或5種miRNA互補(bǔ)的雜交鏈解旋過(guò)孔時(shí)間明顯長(zhǎng)于只含1種miRNA的過(guò)孔時(shí)間，五類(lèi)只含1種miRNA的雜交鏈過(guò)孔時(shí)間也在統(tǒng)計(jì)上存在一點(diǎn)區(qū)分（圖2d，f），并且所有含miRNA的雜交鏈的過(guò)孔時(shí)間都大于HP-dgDNA單鏈的過(guò)孔時(shí)間（圖2e）。同時(shí)，根據(jù)模擬的結(jié)果，研究人員還發(fā)現(xiàn)雜交鏈過(guò)孔時(shí)間是隨著雜交鏈解旋所需能量增大而延長(zhǎng)的（圖2g）。研究人員在圖2中驗(yàn)證了可以利用雜交鏈解旋過(guò)孔的時(shí)間差異來(lái)區(qū)分與HP-dgDNA雜交的miRNA數(shù)量差異，從而匯報(bào)出樣品中miRNA大致的種類(lèi)。

在驗(yàn)證了方法的可行性后，研究人員測(cè)試了該方法針對(duì)臨床樣本的有效性。盡管miR-15a、miR-193、miR-224、miR-106a和miR-374這五種miRNA已經(jīng)被報(bào)道在膽管癌患者中過(guò)表達(dá)，研究人員仍然先使用RT-qPCR對(duì)從血漿樣品中提取的miRNA進(jìn)行定量（圖3a，b），可以發(fā)現(xiàn)相較于健康人而言，癌癥患者中這五種miRNA的表達(dá)量都較高，其中miR-193，miR-106a和miR-15a的表達(dá)量顯著高于健康水平。隨后，研究人員使用納米孔傳感了從血漿中提取的miRNA與HP-dgDNA的雜交鏈（圖3c），可以看到癌癥患者中提取到的miRNA與HP-dgDNA形成雜交鏈的解旋過(guò)孔時(shí)間（1487ms）明顯長(zhǎng)于健康人（856ms）提取到的miRNA雜交鏈的過(guò)孔時(shí)間（圖3e，f）。圖3說(shuō)明了可以根據(jù)雜交鏈的過(guò)孔時(shí)間來(lái)區(qū)分癌癥患者與健康人的miRNA表達(dá)量差異。

最后，研究人員探究了該方法理論上的檢測(cè)限。分別使用0.1、1、10和100fM的miRNA與500nM HP-dgDNA雜交（圖4b，c），可以發(fā)現(xiàn)小于100fM的miRNA雜交鏈過(guò)孔時(shí)間隨著濃度提高而增加，且都大于僅存在HP-dgDNA單鏈的過(guò)孔時(shí)間（圖4f）。因此，研究人員認(rèn)為只要miRNA雜交鏈的過(guò)孔時(shí)間稍大于HP-dgDNA單鏈的過(guò)孔時(shí)間都可以被認(rèn)為實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)，通過(guò)理論計(jì)算可以得到該方法的理論檢測(cè)限為0.3fM。

該論文一經(jīng)發(fā)表就受到領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，上線不到一個(gè)月時(shí)間Altmetric指標(biāo)就達(dá)到了92，但是不可否認(rèn)的是，相較于如此高的關(guān)注度，該方法仍然有很多問(wèn)題亟待解決，如：1）過(guò)時(shí)間被判斷為可區(qū)分的差異程度沒(méi)有定義，很多擬合峰相互重合；2）血漿中提取miRNA是否會(huì)因?yàn)槌诉@五種miRNA以外的其他miRNA與單鏈DNA部分互補(bǔ)從而影響了過(guò)孔時(shí)間；3）癌癥患者的過(guò)孔時(shí)間統(tǒng)計(jì)分布與健康人基本相同，該方法對(duì)患者之間的差異對(duì)疾病診斷的影響。

作者：Nanami Takeuchi， Moe Hiratani， and Ryuji Kawano*