微流控芯片熒光成像系統(tǒng)提高其信噪比

使用傳統(tǒng)的硅-玻璃體系能夠以各種方式制備微流控芯片，易于硅加工和表面修飾，并且有利于后續(xù)應(yīng)用，例如細(xì)胞接種及相關(guān)研究。

目前，細(xì)胞的熒光成像成為研究細(xì)胞行為的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。不幸的是，硅流道底部的不均勻表面影響了通過濾光片的光穿透，致使微流控系統(tǒng)中的高靈敏度熒光成像（例如使用全內(nèi)反射熒光（TIRF）顯微鏡）出現(xiàn)問題。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，西北工業(yè)大學(xué)聯(lián)合捷克科學(xué)院（Czech Academy of Science）生物技術(shù)研究所（Institute of Biotechnology）及查理大學(xué)（Charles University）針對上述問題做了進(jìn)一步研究，他們發(fā)現(xiàn)可以使用絕緣體上硅（SOI）襯底，通過頂部硅層的厚度定義流道深度，以及停止掩埋二氧化硅（SiO2）層的蝕刻來解決這一問題。

如此，熒光背景信號下降到原來的五分之一，對應(yīng)的熒光素檢測限從?0.05毫摩爾提升到?50納摩爾。研究人員證明了使用基于全內(nèi)反射熒光的單分子檢測平坦表面的重要性，與傳統(tǒng)的硅晶圓相比，其信噪比提高了超18倍。

典型的熒光光學(xué)系統(tǒng)包括：光源、激發(fā)濾光片（XF，用于防止不需要的成分激發(fā)光并可能干擾結(jié)果）、二向色鏡（DM，又稱雙色鏡，用于在樣品上反射經(jīng)濾光的激發(fā)光），以及一個發(fā)射濾光片（MF，用于阻擋濾過的激發(fā)光），該系統(tǒng)只允許發(fā)射光通過光學(xué)探測器，該探測器可以是光電二極管、光電倍增管（PMT）或合適的相機(jī)。

研究人員使用了高端濾光片，ET系列型號49002（產(chǎn)自美國佛蒙特州貝洛斯福爾斯的Chroma Technology公司），用于異硫氰酸熒光素（FITC）型熒光。

（A）異硫氰酸熒光素（FITC）濾光片組透射圖，展示激發(fā)濾光片（藍(lán)色）、二向色鏡（紅色）和發(fā)射濾片（綠色）的特性；（B）使用異硫氰酸熒光素濾光片組的Stilla數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）芯片的熒光圖像

研究人員使用納米光刻工具箱設(shè)計微流控芯片（下圖A），它有16個帶有切向管連接的腔室，每個腔室的面積為15mm2，深度為?100μm，體積為1.5nL，并使用計算機(jī)輔助軟件可視化單個腔室（下圖B）。

他們使用傳統(tǒng)的微制造技術(shù)用于微流控芯片，包括使用兩個光刻步驟的圖案化硅襯底和陽極鍵合到硅襯底的非圖案化玻璃蓋。

他們在平坦襯底上進(jìn)行了兩次光刻步驟，這對他們來說，沒有任何挑戰(zhàn)。接著，他們使用博世（Bosch）工藝和基于六氟化硫（SF6）蝕刻和八氟異丁烯（C4F8）聚合物沉積結(jié)合的深反應(yīng)離子蝕刻（DRIE）。這是一種眾所周知的工藝，蝕刻速率極佳。

然后，他們使用陽極鍵合對蝕刻的硅晶片進(jìn)行封蓋，因為玻璃基板上沒有圖案，這意味著不必遵守嚴(yán)格的對準(zhǔn)規(guī)則，這是一項容易的制造任務(wù)。

基于不同表面的微加工工藝展示

研究人員將兩個微流控芯片置于光學(xué)顯微鏡下，并捕獲了兩個硅襯底的暗場圖像，一個由傳統(tǒng)硅晶圓制成（下圖A1），另一個由SOI晶圓制成（下圖A2）。

他們觀察到了傳統(tǒng)硅晶圓制作的腔室底部的強(qiáng)光散射信號，而并沒有從基于SOI的腔室觀察到散射。正是這種散射導(dǎo)致了熒光的背景問題

。他們使用基于配備50倍物鏡的Mireau干涉儀的白光光學(xué)剖面儀測量表面形貌?，使用垂直位移干涉模式（VSI）（下圖B1，B2）。硅襯底表面的粗糙度比SOI襯底大84倍。

（A）經(jīng)20倍物鏡暗場顯微鏡蝕刻后的傳統(tǒng)硅襯底表面圖像；（B）垂直位移干涉模式下SOI襯底（上）與標(biāo)準(zhǔn)硅晶圓襯底（下）的干涉圖像；（C）光電倍增管電壓作為熒光素濃度的函數(shù)，腔室材料類型為參數(shù)，縱軸和橫軸使用對數(shù)刻度；紅色表示傳統(tǒng)的硅襯底，黑色表示SOI襯底。

研究人員將熒光素溶液填充進(jìn)微流控芯片腔室，并將該溶液濃度從?1納摩爾改變至?100微摩爾，同時保持一個空腔作為參考，以確定每個芯片的熒光檢測限（LOD）。然后，他們測量了所有腔室的熒光振幅，并根據(jù)其繪制出熒光素濃度函數(shù)（上圖4C）。基于測量，由傳統(tǒng)硅襯底制成的微流控芯片的熒光檢測限高出約5倍。

在該文章中，研究人員分析了使用微流控芯片進(jìn)行單分子成像的高端濾光片的特性。

他們著重強(qiáng)調(diào)，結(jié)束微流控芯片的陽極鍵合之前的最后一個制造步驟是硅熱氧化，硅熱氧化在900°C下干燥的氧氣（O2）環(huán)境中進(jìn)行，以生長厚度為5nm的二氧化硅（SiO2）層，同時確定腔室表面特性。該環(huán)境中的這一步驟去除了可能附著在原始硅表面的所有微量化學(xué)物質(zhì)。

硅以及用于陽極鍵合的玻璃都不顯示任何自熒光，并且硅和SOI這兩種不同襯底的微流控芯片之間的唯一區(qū)別是底部形貌，其余部分相同。因此，無論效果如何，根本原因是它與表面形貌有關(guān)，并且這種形貌的去除顯著改善了熒光測量（成像）特性。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在使用硅襯底傳統(tǒng)技術(shù)制造微流控芯片時，由于與粗糙結(jié)構(gòu)的底部相關(guān)的各種可能的影響，高分辨率成像（如用于單分子運動測定的全內(nèi)反射熒光技術(shù)）并沒有達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。他們研究了這一現(xiàn)象，并證明了用SOI襯底替代傳統(tǒng)硅襯底的解決方案，可保證微流控芯片的平坦底部，同時允許全內(nèi)反射熒光技術(shù)通過使用488nm波長的照明來確定單分子運動性，從而最大限度地發(fā)揮其潛力。

昂貴的SOI晶圓可能會被傳統(tǒng)的硅晶圓取代，并允許通過合適的平滑技術(shù)（例如基于氫氟酸（HF）/硝酸（HNO3）蝕刻技術(shù)）進(jìn)行微流控腔室蝕刻。無論如何，與芯片制造相比，原始襯底的成本通常是相當(dāng)?shù)偷?，尤其是與包括單分子測試在內(nèi)的后續(xù)應(yīng)用相比，這證明了這種高襯底成本的合理性。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41598-022-23426-z

審核編輯：劉清