用于生物膜感染糖尿病傷口愈合的防治一體化納米酶微針

如何促進(jìn)細(xì)菌生物膜感染的糖尿病傷口的愈合是一項亟需解決的全球公共衛(wèi)生問題。然而，由于生物膜感染部位的低藥物滲透性及傷口愈合中潛在的再感染風(fēng)險，現(xiàn)有的治療方法療效受限。

近期，中國藥科大學(xué)戴建君/鞠艷敏團(tuán)隊設(shè)計了一種防治一體化的納米酶微針（Fe2C/GOx@MNs）用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）生物膜感染的糖尿病傷口愈合。具有足夠機(jī)械強(qiáng)度的可溶性針尖可提高Fe2C納米顆粒（Fe2C NPs）及葡萄糖氧化酶（GOx）的滲透能力以實(shí)現(xiàn)高效的生物膜消除。與此同時，具有良好的透氣性、吸濕性和抗菌性殼聚糖背襯層（CS）可防止傷口愈合過程中的再次感染。重要的是，F(xiàn)e2C/GOx@MNs的生物膜清除和再感染預(yù)防能力在MRSA生物膜感染的糖尿病小鼠傷口模型中亦得到了證實(shí)，表明其在細(xì)菌生物膜感染傷口愈合方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。該研究以“An Integrated Therapeutic and Preventive Nanozyme-Based Microneedle for Biofilm-Infected Diabetic Wound Healing”為題發(fā)表在Advanced Healthcare Materials期刊上。

該研究以負(fù)載Fe2C NPs和GOx的高生物相容性的聚乙烯醇（PVA）作為可溶性針尖，以5%CS溶液作為背襯層，最終經(jīng)過干燥、脫模得到防治一體化的分層微針（Fe2C/GOx@MNs）。該微針應(yīng)用于生物膜感染的傷口組織時，其針尖可突破傷口部位腐爛組織及致密生物膜所產(chǎn)生的滲透屏障，借助傷口部位組織液將具有抗菌活性的Fe2C NPs/GOx快速釋放入生物膜內(nèi)部。盟友GOx的加入打破了傷口部位pH和H2O2濃度對Fe2C NPs抗生物膜能力的限制，加速M(fèi)RSA生物膜的清除。進(jìn)一步的研究闡明大量·OH的產(chǎn)生及細(xì)菌氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡是Fe2C/GOx@MNs主要的抗生物膜機(jī)制。此外，殼聚糖背襯層具備良好的透氣性、吸濕性和抗菌性能，不僅作為在傷口與外部環(huán)境之間的物理屏障作用，還阻止了環(huán)境中細(xì)菌在傷口愈合過程中發(fā)起的再次入侵（方案1）。以上結(jié)果證明該防治一體化納米酶微針有可能成為理想的促進(jìn)生物膜感染的糖尿病傷口愈合的候選材料，并可應(yīng)用于各種相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

方案1 Fe2C/GOx@MNs清除糖尿病創(chuàng)面MRSA生物膜及預(yù)防再感染示意圖

Fe2C/GOx@MNs的制備與表征

將Fe2C NPs與GOx及25%PVA溶液混勻經(jīng)離心以填充到聚二甲基硅氧烷模具腔中，然后輕輕加入5%CS的醋酸溶液覆蓋針尖，最終脫模得到微針貼片。為了確保Fe2C/GOx@MNs能突破傷口部位腐爛組織及致密生物膜所產(chǎn)生的滲透屏障，研究者對其結(jié)構(gòu)及針尖機(jī)械性能進(jìn)行全方位的測定，證實(shí)該微針貼片呈現(xiàn)分層結(jié)構(gòu)且針尖具有足夠的機(jī)械力（0.7 N/針），能夠成功穿刺皮膚。具有優(yōu)良的吸濕性能和抗菌性能的背襯層可通過吸收創(chuàng)面滲出液抑制創(chuàng)面化膿，防止再感染的發(fā)生。研究者通過進(jìn)一步的探索發(fā)現(xiàn)CS背襯層不僅呈現(xiàn)吸濕溶脹性能，且對MRSA具有顯著的殺傷能力。

大量的研究表明高水平的H2O2和低pH可以增強(qiáng)納米酶活性。GOx可以催化葡萄糖分解生成H2O2和葡萄糖酸，已被報道可用于打破來源于環(huán)境的H2O2和pH限制。因此，在該研究中，研究者借助草酸鈦鉀、pH計及3,3'，5,5' -四甲基聯(lián)苯胺對反應(yīng)體系中H2O2、酸堿度及·OH進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GOx的加入提升了反應(yīng)體系中H2O2的濃度同時也降低了pH值。更重要的是，F(xiàn)e2C NPs的類過氧化物酶活性得到了大大的增強(qiáng)，產(chǎn)生了更多的·OH。該結(jié)果在溶液體系及微針貼片中均得到了證實(shí)（圖1）。

圖1 Fe2C/GOx@MNs表征

Fe2C NPs/GOx體外抗生物膜性能測定及機(jī)理研究

在將Fe2C NPs/GOx裝入MNs之前，研究者在模擬糖尿病傷口條件下通過標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法、結(jié)晶紫法、熒光染色法對其體外抗菌性能進(jìn)行評估。結(jié)果表明Fe2C NPs/GOx在體外呈現(xiàn)強(qiáng)的抗生物膜性能，其生物膜清除率高達(dá)93.21 ± 0.37%，且GOx的加入對生物膜的清除起正向促進(jìn)作用（圖2）。

圖2 Fe2C NPs/GOx體外抗生物膜性能及其對EPS的損傷能力測定

為了進(jìn)一步闡明Fe2C NPs/GOx的抗生物膜機(jī)制，研究者通過細(xì)致研究及多次驗(yàn)證，將其抗生物膜機(jī)理總結(jié)如下：首先，·OH通過破壞胞外基質(zhì)的主要成分（eDNA、PIA和蛋白質(zhì)）誘導(dǎo)生物膜結(jié)構(gòu)解體。隨后，MRSA的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁被破壞，細(xì)胞內(nèi)成分（離子、蛋白質(zhì)和DNA）外排。其次，磷酸戊糖途徑的抑制及相關(guān)酶的失活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量降低，進(jìn)而破壞了細(xì)菌氧化還原穩(wěn)態(tài)。最后，·OH超載進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌基因組DNA斷裂，代謝抑制，加劇細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，最終實(shí)現(xiàn)生物膜清除（圖3）。

圖3 Fe2C NPs/GOx抗生物膜機(jī)制

Fe2C/GOx@MNs體內(nèi)抗生物膜性能測定及促傷口愈合能力評估

鑒于Fe2C NPs/GOx出色的體外抗生物膜活性，研究者隨后在MRSA生物膜感染的糖尿病傷口模型中評估了Fe2C/GOx@MNs的抗生物膜性能和促傷口愈合能力。結(jié)果表明相比于溶液處理組，微針處理組的生物膜清除率及傷口愈合率明顯得到了提升。更重要的是，在GOx的輔助下，抗生物膜能力增強(qiáng)，傷口愈合速率加快，F(xiàn)e2C/GOx@MNs（PVA）組和Fe2C/GOx@MNs組在第9天幾乎看不到傷口，且僅有少量MRSA菌落被觀察到。

為了進(jìn)一步明確Fe2C NPs/GOx的促傷口愈合能力，研究者利用H&E染色、Masson染色和免疫熒光染色對傷口組織進(jìn)行評估。結(jié)果表明，F(xiàn)e2C/GOx@MNs通過減少炎癥、促進(jìn)膠原沉積、加速血管生成和成熟，對MRSA生物膜感染的糖尿病創(chuàng)面愈合具有顯著的促進(jìn)作用（圖4）。

圖4 Fe2C/GOx@MNs體內(nèi)抗生物膜性能及促傷口愈合能力評估

Fe2C/GOx@MNs體內(nèi)預(yù)防再感染能力評估

雖然優(yōu)良的抗生物膜能力對于傷口的愈合是必要的，但是未愈合的傷口暴露在空氣中很容易會出現(xiàn)再次感染，進(jìn)一步阻礙傷口的愈合。基于此，研究者通過將MRSA菌液滴加到微針貼片處理后的傷口處以模擬再次感染的發(fā)生，從而驗(yàn)證微針貼片CS背襯層的預(yù)防再感染能力。結(jié)果表明，菌液處理后，PVA組創(chuàng)面面積明顯增大而CS背襯層組則減小且與對照組無差異，證明CS背襯層能夠殺死入侵的MRSA，保護(hù)未愈合創(chuàng)面。另外，標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法和革蘭氏染色的結(jié)論與上述一致（圖5）。

圖5 Fe2C/GOx@MNs體內(nèi)預(yù)防再感染性能評估

綜上所述，研究者設(shè)計了一種基于納米酶的防治一體化Fe2C/GOx@MNs微針貼片，并在體內(nèi)外水平對其抗生物膜性能及促傷口愈合能力進(jìn)行了全面的驗(yàn)證。該微針貼片的可溶性針尖可克服各種物理障礙，將Fe2C NPs/GOx遞送至生物膜內(nèi)部，高效去除生物膜。同時，具有良好透氣性、吸濕性和抗菌性的殼聚糖背襯層可以防止傷口愈合過程中再次感染。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示GOx對Fe2C NPs有增強(qiáng)的抗菌作用。同時，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明微針的應(yīng)用可以提高抗生物膜效果。此外，CS保護(hù)層在體內(nèi)的再感染預(yù)防能力也得到了驗(yàn)證。上述工作表明該平臺在生物膜感染傷口愈合和保護(hù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

審核編輯：劉清