基因芯片的工作原理及技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用

1　基因芯片概述

　　隨著人類基因組計(jì)劃( Human Genome Project)即全部核苷酸測序的即將完成，人類基因組研究的重心逐漸進(jìn)入后基因組時代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多樣性傾斜。通過對個體在不同生長發(fā)育階段或不同生理狀態(tài)下大量基因表達(dá)的平行分析，研究相應(yīng)基因在生物體內(nèi)的功能，闡明不同層次多基因協(xié)同作用的機(jī)理，進(jìn)而在人類重大疾病如癌癥、心血管疾病的發(fā)病機(jī)理、診斷治療、藥物開發(fā)等方面的研究發(fā)揮巨大的作用。它將大大推動人類結(jié)構(gòu)基因組及功能基因組的各項(xiàng)基因組研究計(jì)劃。

　　基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法（southern 、northern）是一致的，都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因，進(jìn)行大信息量的篩選與檢測分析?；蛐酒饕夹g(shù)流程包括：芯片的設(shè)計(jì)與制備；靶基因的標(biāo)記；芯片雜交與雜交信號檢測。

　　基因芯片的設(shè)計(jì)實(shí)際上是指芯片上核酸探針序列的選擇以及排布，設(shè)計(jì)方法取決于其應(yīng)用目的，目前的應(yīng)用范圍主要包括基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄圖譜分析及靶序列中單堿基多態(tài)位點(diǎn)（single nucleoTIde polymorphism，SNP）或突變點(diǎn)的檢測，表達(dá)型芯片的目的是在雜交實(shí)驗(yàn)中對多個不同狀態(tài)樣品(不同組織或不同發(fā)育階段、不同藥物刺激)中數(shù)千基因的表達(dá)差異進(jìn)行定量檢測，探針序列一般來自于已知基因的cDNA 或EST庫，設(shè)計(jì)時序列的特異性應(yīng)放在首要位置，以保證與待測目的基因的特異結(jié)合，對于同一目的基因可設(shè)計(jì)多個序列不相重復(fù)的探針，使最終的數(shù)據(jù)更為可靠。基因單堿基多態(tài)檢測的芯片一般采用等長移位設(shè)計(jì)法，即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互補(bǔ)的核苷酸序列形成一探針組合，這組探針是與靶序列完全匹配的野生型探針，然后對于每一野生型探針，將其中間位置的某一堿基分別用其它三種堿基替換，形成三種不同的單堿基變化的核苷酸探針，這種設(shè)計(jì)可以對某一段核酸序列所有可能的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行掃描。

　　芯片制備方法主要包括兩種類型：(1)點(diǎn)樣法：首先是探針庫的制備, 根據(jù)基因芯片的分析目標(biāo)從相關(guān)的基因數(shù)據(jù)庫中選取特異的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后通過計(jì)算機(jī)控制的三坐標(biāo)工作平臺用特殊的針頭和微噴頭分別把不同的探針溶液逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍以及其它固相基片表面的不同位點(diǎn)上，通過物理和化學(xué)的方法使之固定，該方法各技術(shù)環(huán)節(jié)均較成熟，且靈活性大，適合于研究單位根據(jù)需要自行制備點(diǎn)陣規(guī)模適中的基因芯片。(2)原位合成法：該法是在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成寡核苷酸探針陣列，目前應(yīng)用的主要有光去保護(hù)并行合成法，壓電打印合成法等，其關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和高合成產(chǎn)率的DNA化學(xué)合成技術(shù)，適合制作大規(guī)模DNA探針芯片，實(shí)現(xiàn)高密度芯片的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)。

　　待分析樣品的制備是基因芯片實(shí)驗(yàn)流程的一個重要環(huán)節(jié), 靶基因在與芯片探針結(jié)合雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。標(biāo)記方法根據(jù)樣品來源、芯片類型和研究目的的不同而有所差異。通常是在待測樣品的PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄過程中實(shí)現(xiàn)對靶基因的標(biāo)記。對于檢測細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平的芯片，一般需要從細(xì)胞和組織中提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并加入偶聯(lián)有標(biāo)記物的dNTP，從而完成對靶基因的標(biāo)記過程，對于陣列密度較小的芯片可以用同位素，所需儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用設(shè)備，易于開展相關(guān)工作，但是在信號檢測時，一些雜交信號強(qiáng)的點(diǎn)陣容易產(chǎn)生光暈，干擾周圍信號的分析。高密度芯片的分析一般采用熒光素標(biāo)記靶基因，通過適當(dāng)內(nèi)參的設(shè)置及對熒光信號強(qiáng)度的標(biāo)化可對細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。近年來運(yùn)用的多色熒光標(biāo)記技術(shù)可更直觀地比較不同來源樣品的基因表達(dá)差異，即把不同來源的靶基因用不同激發(fā)波長的熒光素標(biāo)記，并使它們同時與基因芯片雜交，通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖獲得不同樣品間差異表達(dá)基因的圖譜，常用的雙色熒光試劑有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。對多態(tài)性和突變檢測型基因芯片采用多色熒光技術(shù)可以大大提高芯片的準(zhǔn)確性和檢測范圍，例如用不同的熒光素分別標(biāo)記靶序列及單堿基失配的參考序列，使它們同時與芯片雜交，通過不同熒光強(qiáng)弱的比較得出靶序列中堿基失配的信息。

　　基因芯片與靶基因的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同，雜交反應(yīng)的條件要根據(jù)探針的長度、GC堿基含量及片的類型來優(yōu)化，如用于基因表達(dá)檢測，雜交的嚴(yán)格性較低，而用于突變檢測的芯片的雜交溫度高，雜交時間短，條件相對嚴(yán)格。如果是用同位素標(biāo)記靶基因，其后的信號檢測即是放射自顯影，若用熒光標(biāo)記，則需要一套熒光掃描及分析系統(tǒng)，對相應(yīng)探針陣列上的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析比較，從而得到待測樣品的相應(yīng)信息。由于基因芯片獲取的信息量大，對于基因芯片雜交數(shù)據(jù)的分析、處理、查詢、比較等需要一個標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)格式，目前，一個大型的基因芯片的數(shù)據(jù)庫正在構(gòu)建中，將各實(shí)驗(yàn)室獲得的基因芯片的結(jié)果集中起來，以利于數(shù)據(jù)的交流及結(jié)果的評估與分析。