張江發(fā)明了一種新型成像技術(shù)——共聚焦光場(chǎng)顯微鏡

北京時(shí)間8月10日深夜23點(diǎn)，《自然-生物技術(shù)》雜志在線發(fā)表了題為《共聚焦光場(chǎng)顯微鏡對(duì)小鼠和斑馬魚(yú)大腦快速體成像》的研究論文，來(lái)自上海腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心（張江）、中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家們共同完成了生命科學(xué)領(lǐng)域不可多得的“中國(guó)制造”，再度讓世人驚嘆。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)

就是來(lái)自張江的科學(xué)家們發(fā)明了一種新型成像技術(shù)——共聚焦光場(chǎng)顯微鏡（Confocal light field microscopy），可以對(duì)活體動(dòng)物深部腦組織中的神經(jīng)和血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行快速、大范圍的活體成像。

有了這項(xiàng)“利器”，科學(xué)家們就可以為腦部細(xì)胞拍攝“工作照”，更深入地了解大腦是如何展開(kāi)工作的，為解開(kāi)“大腦之謎”奠定基礎(chǔ)。

何為共聚焦光場(chǎng)顯微鏡？

在人類(lèi)探索自身奧秘的旅程中，大腦的秘密是其中最難以攀登，卻又最令人向往的一座高峰。我們的大腦中有著數(shù)以?xún)|計(jì)的細(xì)胞，其中，神經(jīng)元約有860億，這個(gè)數(shù)字比目前地球上人口總和的十倍還要多。

如果我們把每一個(gè)神經(jīng)元看作是一個(gè)人，那我們的大腦就像是一個(gè)非常復(fù)雜而龐大的社會(huì)，它的正常運(yùn)轉(zhuǎn)離不開(kāi)每一個(gè)人的分工協(xié)作。這些神經(jīng)元到底是如何一起工作的，就是神經(jīng)科學(xué)中研究的核心問(wèn)題。

如果我們把每個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)軌跡都繪制出來(lái)，所看到的就像是一團(tuán)亂麻，無(wú)法知道它們到底在神經(jīng)環(huán)路中扮演著什么樣的角色。

那么，應(yīng)該怎樣去研究這個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題呢？

方法之一就是用聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡這些傳統(tǒng)的活體成像工具進(jìn)行掃描，以此來(lái)判斷它們的運(yùn)動(dòng)軌跡。可是，由于時(shí)間分辨率較低，它們難以捕捉到神經(jīng)元的快速變化，當(dāng)然也就不可能進(jìn)行大范圍的研究。

因此，近年來(lái)人們一直致力于開(kāi)發(fā)更快的成像方法。在多種新技術(shù)中，光場(chǎng)顯微鏡尤其具有潛力，得到了廣泛關(guān)注。這種顯微鏡的特點(diǎn)是可以在相機(jī)的單次曝光瞬間，記錄來(lái)自物體不同深度的信號(hào)，通過(guò)反卷積算法重構(gòu)出整個(gè)三維體，實(shí)現(xiàn)快速活體成像。

這種方法已經(jīng)在線蟲(chóng)、斑馬魚(yú)幼魚(yú)等小型模式動(dòng)物上獲得了初步應(yīng)用，看上去似乎很完美了，是不是？其實(shí)不然。

傳統(tǒng)的光場(chǎng)顯微鏡

還存在兩個(gè)難以解決的問(wèn)題

限制了它在生物成像上的廣泛應(yīng)用

首先，重構(gòu)的結(jié)果會(huì)出現(xiàn)失真；

其次，現(xiàn)有光場(chǎng)顯微成像技術(shù)缺乏光學(xué)切片能力，無(wú)法對(duì)較厚組織，比如小鼠的大腦進(jìn)行成像。

連小鼠關(guān)都過(guò)不了，更別說(shuō)應(yīng)用于人體了。

那么，接下里的關(guān)鍵步驟就是如何克服重構(gòu)失真問(wèn)題以及讓光場(chǎng)顯微鏡具有共聚焦顯微鏡一樣的光學(xué)切片能力。

2017年，上述團(tuán)隊(duì)的科學(xué)家們就研發(fā)了新型擴(kuò)增視場(chǎng)光場(chǎng)顯微鏡，有效解決了重構(gòu)失真的問(wèn)題，并首次三維記錄了斑馬魚(yú)幼魚(yú)在完整捕食行為中的全腦神經(jīng)元活動(dòng)變化。

歷經(jīng)三年的科技攻關(guān)，研究團(tuán)隊(duì)這次又提出了廣義共聚焦檢測(cè)的概念，使其可以與光場(chǎng)顯微鏡的三維成像策略結(jié)合，在不犧牲體成像速度的前提下有效濾除背景噪聲，大幅度提高了靈敏度和分辨率。這種新型的光場(chǎng)顯微成像技術(shù)被稱(chēng)為——共聚焦光場(chǎng)顯微鏡。

（上）共聚焦光場(chǎng)顯微鏡原理示意圖。

（下）不同于傳統(tǒng)光場(chǎng)顯微鏡，共聚焦光場(chǎng)顯微鏡采用片狀照明，選擇性激發(fā)樣本的一部分，在垂直照明的方向上掃描，采集到的信號(hào)被遮擋板過(guò)濾掉焦層范圍之外的部分。對(duì)采集到的圖像進(jìn)行重構(gòu)可以得到焦層內(nèi)的三維信息。

為腦細(xì)胞抓拍“工作照”

“工欲善其事，必先利其器?！惫ぞ邷?zhǔn)備好了，接下來(lái)就要去給腦細(xì)胞拍“工作照”了。

研究團(tuán)隊(duì)在不同動(dòng)物樣品上測(cè)試了共聚焦光場(chǎng)顯微鏡的成像能力。

（左）斑馬魚(yú)幼魚(yú)捕食行為的一個(gè)例子。0s 為斑馬魚(yú)吞食草履蟲(chóng)的時(shí)刻。（右）左圖斑馬魚(yú)捕食行為中，共聚焦光場(chǎng)顯微鏡記錄到的兩個(gè)不同腦區(qū)的神經(jīng)元活動(dòng)。箭頭所指為過(guò)程中激活的單個(gè)神經(jīng)元。

首先，團(tuán)隊(duì)成員對(duì)活體斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行全腦鈣成像。對(duì)比共聚焦和傳統(tǒng)光場(chǎng)顯微鏡的成像結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)加入光學(xué)切片能力后，圖像分辨率和信號(hào)噪聲比顯著提高，可以檢測(cè)到更多較弱的鈣活動(dòng)。

科學(xué)家們進(jìn)一步將共聚焦光場(chǎng)顯微鏡和高速三維追蹤系統(tǒng)結(jié)合，對(duì)自由行為的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行全腦鈣成像。受益于更高的分辨率和靈敏度，可以識(shí)別出斑馬魚(yú)幼魚(yú)在捕食草履蟲(chóng)過(guò)程中單個(gè)神經(jīng)元的鈣離子活動(dòng)的變化。

（左）共聚焦光場(chǎng)顯微鏡拍攝得到的小鼠視皮層中的復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)。6個(gè)在不同深度拍攝的體積連接為一個(gè)深度達(dá)600 μm的三維結(jié)構(gòu)。（中）100 μm到250 μm深度血管網(wǎng)絡(luò)的平面投影，顏色代表不同血管分支中血細(xì)胞的平均流速。（右）圖中箭頭所指的區(qū)域中五個(gè)血管分支在一段時(shí)間內(nèi)流過(guò)血細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)。

緊接著，團(tuán)隊(duì)成員又開(kāi)始驗(yàn)證共聚焦光場(chǎng)顯微鏡對(duì)小鼠大腦的成像效果。對(duì)清醒小鼠的視皮層進(jìn)行鈣成像，不僅可以同時(shí)記錄一定體積內(nèi)近千個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)，并且連續(xù)5小時(shí)以上穩(wěn)定記錄超過(guò)10萬(wàn)幀，沒(méi)有明顯的光漂白。

團(tuán)隊(duì)成員進(jìn)一步嘗試使用共聚焦光場(chǎng)顯微鏡對(duì)鼠腦中的血細(xì)胞進(jìn)行成像，同時(shí)記錄上千根血管分支中群體血細(xì)胞的流動(dòng)情況并計(jì)算血細(xì)胞的速度，相比之前的傳統(tǒng)成像方法通量提高了百余倍。

研究團(tuán)隊(duì)在自由行為的斑馬魚(yú)幼魚(yú)和小鼠大腦上的試驗(yàn)證明了——共聚焦光場(chǎng)顯微鏡有更高的分辨率和靈敏度，這就為研究大范圍神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和血管網(wǎng)絡(luò)的功能提供了新的工具。同時(shí)，這項(xiàng)技術(shù)不僅適用腦組織的成像，還可以根據(jù)所需成像的樣品種類(lèi)靈活調(diào)整分辨率、成像范圍和速度，應(yīng)用在其他厚組織的快速動(dòng)態(tài)成像中。

現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)的奠基者、西班牙科學(xué)家拉蒙·卡哈爾曾經(jīng)說(shuō)過(guò)：“只要大腦的奧秘尚未大白于天下，宇宙將仍是一個(gè)謎?！?/p>

大腦是控制機(jī)體所有功能的中樞，“因?yàn)橛辛四X，我們才有了樂(lè)趣、欣喜與歡笑，才有了絕望、哀愁與無(wú)盡的憂思。因?yàn)橛辛四X，我們才看得見(jiàn)，才聽(tīng)得到。因?yàn)橛辛四X，我們才以一種獨(dú)特的方式擁有了智慧，獲得了知識(shí)”。

這些張江科學(xué)家的最新發(fā)明讓我們離攀登腦科學(xué)的高峰又近了一步，而且是在科技最前沿的生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了難得的“中國(guó)制造”。讓我們?yōu)檫@些不懈努力、孜孜以求的科學(xué)家們喝彩！